전문가 중 누가 PCR 기술의 과정을 자세히 설명해줄 수 있나요?

폴리머라제 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 폴리머라제 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)

PCR이라고도 합니다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 시험관 내에서 특정 DNA 단편을 효소적으로 합성하는 방법으로 고온 변성, 저온 어닐링(renaturation), 적절한 온도 연장 등 여러 단계로 구성됩니다. 빠른 증폭, 강한 특이성, 높은 민감도, 쉬운 조작, 시간 절약 등을 통해 타겟 DNA를 합성할 수 있습니다. 유전자 분리, 클로닝, 핵산 서열 분석 등 기초 연구뿐만 아니라 질병 진단이나 DNA, RNA가 존재하는 모든 곳에서 활용이 가능하다. PCR(Polymerase Chain Reaction)은 무세포 분자 클로닝 또는 특정 DNA 서열의 시험관 내 프라이머 지정 효소 증폭 기술이라고도 합니다.

이 단락의 발전 과정에 대한 간략한 역사를 편집하세요

핵산에 대한 인간의 연구는 100년이 넘는 역사를 가지고 있습니다. 1960년대 후반과 1970년대 초반에 사람들은 체외 유전자 분리 기술 연구에 전념했습니다. 그러나 핵산의 함량이 낮기 때문에 시험관 내에서 DNA를 조작하는 것은 어느 정도 제한됩니다. Khorana는 1971년에 처음으로 핵산의 시험관 증폭 아이디어를 제안했습니다. 그러나 당시에는 유전자 서열 분석 방법이 아직 성숙되지 않았고, 열적 안정성이 강한 DNA 중합효소도 아직 발견되지 않았으며, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성은 아직 수동 및 반자동 합성 단계에 머물러 있었다는 생각은 들지 않았습니다. 실질적인 의미가 있습니다. 1985년 미국 과학자 Kary Mullis는 고속도로에서 영감을 받아 2년간의 노력 끝에 PCR 기술을 발명하고 Science지에 PCR 기술에 관한 최초의 학술 논문을 발표했습니다. 이후 PCR 기술은 생명과학계에서 전반적으로 인정받았고, Kary Mullis는 1993년 노벨 화학상을 수상했습니다. 그러나 초기 PCR 기술은 당시에는 상당히 미성숙했고, 작동이 복잡하고 비용이 많이 들고 “별로 유용하지 않은” 실험실 기술이었습니다. 1988년 초, 케오하녹은 사용된 효소를 개선하여 증폭의 신뢰성을 향상시켰습니다. 이후 사이키 등은 옐로스톤 공원 온천에 서식하는 수생 호열성 세균으로부터 내열성 DNA 중합효소를 추출해 PCR 기술의 증폭 효율을 크게 향상시켰다. PCR 기술이 널리 사용된 것은 바로 이 효소의 발견으로 인해 이 기술이 유전 및 분자 생물학 분석의 근본적인 초석이 되었습니다. 이후 수십 년 동안 PCR 방법은 지속적으로 개선되었습니다. 정성 분석 방법에서 정량 분석 ​​방법으로 발전하여 원래 유전자에서 몇 kb만 증폭할 수 있었지만 지금은 수십 kb의 DNA 단편을 증폭할 수 있습니다. 지금까지 PCR 기술은 12가지가 넘습니다. 예를 들어 PCR과 역전사 효소를 결합하면 역전사 PCR이 되고, PCR과 항체를 결합하면 면역 PCR이 됩니다.

이 단락의 기술적 원리를 편집하세요

DNA의 반보존적 복제는 생물학적 진화와 생성의 중요한 방식입니다. 이중 가닥 DNA는 다양한 효소의 작용으로 변성되고 단일 가닥으로 용해될 수 있으며, DNA 중합효소와 프로모터의 참여로 상보적인 염기쌍의 원리에 따라 두 개의 동일한 분자로 복사됩니다. 중합효소연쇄반응 실험에서는 DNA가 고온에서 변성되고 녹을 수 있으며, 온도가 낮아지면 이중가닥으로 다시 변할 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다. 따라서 온도 변화를 통해 DNA의 변성과 재생을 조절하고, 프라이머를 프로모터로 설계하고, DNA 폴리머라제와 dNTP를 첨가함으로써 특정 유전자의 in vitro 복제를 완성할 수 있습니다. 그러나 DNA 중합효소는 고온에서 비활성화되기 때문에 각 주기마다 새로운 DNA 중합효소를 첨가해야 하며 이는 작동이 번거로울 뿐만 아니라 비용이 많이 들고 PCR 기술의 적용 및 개발을 제한합니다. 내열성 DNA 중합효소인 Taq 효소의 발견은 PCR 적용에 있어서 획기적인 사건입니다. 이 효소는 불활성화 없이 90°C 이상의 고온에서도 견딜 수 있어 PCR 기술이 매우 간단합니다. 동시에 비용이 크게 절감되었으며 PCR 기술이 널리 사용되고 점차 임상 실습에 적용되었습니다.

이 단락 편집 작동 원리

DNA의 자연 복제 과정과 유사하게 DNA의 특이성은 표적 서열의 양쪽 말단에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의존합니다. PCR은 세 가지 기본 반응 단계로 구성됩니다: 변성 - 어닐링(renaturation) - 연장: ① 주형 DNA의 변성: 중합효소연쇄반응 후 주형 DNA를 일정 시간 동안 약 94°C로 가열하여 해리합니다. 주형 DNA의 이중나선 DNA 또는 PCR 증폭으로 형성된 이중나선 DNA를 단일가닥으로 만들어 프라이머와 결합하여 다음 반응을 준비하는 단계; 주형 DNA와 프라이머: 주형 DNA를 가열하여 단일 가닥으로 변성시킨 후 온도를 약 40~60°C로 낮추고 주형 DNA 단일 가닥의 상보적인 서열과 프라이머 쌍을 이루는 단계; DNA 주형-프라이머 접합체는 dNTP를 반응원료로, 표적 서열을 주형으로 하여 약 72°C에서 DNA 중합효소의 작용하에 염기쌍 형성과 반보존적 복제의 원리에 따라 결합되는 새로운 주형 DNA 가닥에 상보적인 반보존적 복제 가닥이 합성되고 변성-어닐링-신장 주기가 반복됩니다. 세 가지 과정을 거쳐 더 많은 "반보존 복제 사슬"을 얻을 수 있으며, 이 새로운 사슬은 다음 주기의 주형이 될 수 있습니다. .

각 주기를 완료하는 데 2~4분이 소요되며, 증폭하려는 타겟 유전자는 2~3시간 안에 수백만 배 증폭될 수 있습니다.

이 단락의 반응 특성 편집

강한 특이성 PCR 반응의 구체적인 결정 요인은 다음과 같습니다: ① 프라이머와 템플릿 DNA의 구체적이고 올바른 조합 ② 염기쌍의 원리; Taq DNA 중합 효소 합성 반응의 충실도 ④ 표적 유전자의 특이성 및 보존성. 프라이머와 템플릿의 올바른 조합이 핵심입니다. 프라이머가 주형에 결합하고 프라이머 사슬이 확장되는 과정은 염기쌍의 원리를 따릅니다. Polymerase 합성 반응의 충실도와 Taq DNA Polymerase의 고온 내성으로 인해 반응에서 주형과 프라이머의 결합(renaturation)이 더 높은 온도에서 수행될 수 있어 결합의 특이성이 크게 높아집니다. 증폭된 표적 유전자는 Fragment로도 높은 정확도를 유지할 수 있습니다. 특이성과 보존성이 높은 타겟 유전자 영역을 선택하면 특이도가 더욱 높아집니다. 고감도: 생성되는 PCR 산물의 양이 기하급수적으로 증가하며, 테스트할 시작 템플릿을 피코그램(pg=10-12) 수준에서 마이크로그램(μg=10-6) 수준까지 증폭시킬 수 있습니다. 1백만 개의 세포 중 하나의 표적 세포를 검출할 수 있으며, 바이러스 검출에서 PCR의 민감도는 세균학에서 3 RFU(플라크 형성 단위)에 도달할 수 있으며 최소 검출 속도는 3개 박테리아입니다. 간단하고 빠른 PCR 반응은 고온 저항성 Taq DNA Polymerase를 사용하여 반응액을 한번에 첨가한 후 DNA 증폭용액과 water Bath에서 denaturation-annealing-extension 반응을 진행하여 증폭이 보통 2~3회에 완료됩니다. 4시간 동안 반응을 증가시킵니다. 증폭산물은 일반적으로 전기영동법으로 분석하는데, 반드시 동위원소를 사용할 필요는 없으며 방사능 오염이 없으며 촉진이 용이합니다. 샘플 순도에 대한 요구 사항은 낮습니다. 바이러스나 박테리아 및 배양 세포를 분리할 필요가 없습니다. 조 DNA와 RNA 모두 증폭 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 혈액, 체강액, 세척액, 모발, 세포, 생체 조직 등 임상 검체에서 DNA 증폭 검출에 직접 사용할 수 있습니다.

이 단락에서 반응의 5가지 요소를 편집하세요

PCR 반응에는 5가지 주요 물질, 즉 프라이머, 효소, dNTP, 템플릿 및 Mg2+ 프라이머가 있습니다. 프라이머는 PCR 산물의 특이성은 주형 DNA에 대한 프라이머의 상보성 정도에 따라 달라집니다. 이론적으로는 어떤 주형 DNA의 서열만 알면 그 서열에 따라 상보적인 올리고뉴클레오티드 사슬을 프라이머로 설계할 수 있으며, PCR을 이용하면 시험관 내에서 주형 DNA를 대량으로 증폭시킬 수 있다. 프라이머를 디자인할 때 다음 원칙을 따라야 합니다. ① 프라이머 길이: 15-30bp, 일반적으로 사용되는 20bp 정도입니다. ② Primer 증폭폭 : 200-500bp가 적당하며, 조건에 따라 최대 10kb까지 증폭 가능합니다. ③ 프라이머 베이스: G+C 함량은 40~60%가 바람직합니다. G+C가 너무 적으면 증폭 효과가 떨어지고, G+C가 너무 많으면 불특정 밴드가 생기기 쉽습니다. ATGC는 5개 이상의 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드의 클러스터를 피하기 위해 무작위로 분포되는 것이 가장 좋습니다. ④ 프라이머 내의 2차 구조를 피하고 두 프라이머 사이의 상보성을 피하십시오. 특히 3' 말단의 상보성을 피하십시오. 그렇지 않으면 프라이머 다이머가 형성되고 비특이적 증폭 밴드가 생성됩니다. ⑤프라이머 3' 말단의 염기, 특히 마지막 염기와 끝에서 두 번째 염기의 염기를 엄격하게 일치시켜야 말단 염기의 불일치로 인한 PCR 실패를 방지할 수 있습니다. ⑥ 프라이머에는 적절한 효소 절단 부위가 있거나 추가될 수 있습니다. 증폭된 표적 서열에는 적절한 효소 절단 부위가 있는 것이 가장 좋으며 이는 효소 절단 분석이나 분자 클로닝에 매우 유용합니다. ⑦프라이머의 특이성: 프라이머는 핵산 서열 데이터베이스의 다른 서열과 명백한 상동성을 가지지 않아야 합니다. 프라이머 양: 각 프라이머의 농도는 0.1~1umol 또는 10~100pmol입니다. 필요한 결과를 얻으려면 가장 낮은 프라이머 양을 사용하는 것이 좋습니다. 프라이머 농도가 높을 경우 불일치 및 비특이적 증폭이 발생할 수 있습니다. 프라이머 간의 이중 집합 가능성.

이 단락의 반응 시스템 및 반응 조건 편집

표준 PCR 반응 시스템: 10× 증폭 완충액 10ul 4종 dNTP 혼합물 200umol/L 각 10~100pmol; ; template DNA0 .1~2ug TaqDNA 중합효소 2.5u Mg2+1.5mmol/L 100ul에 이중 또는 삼중 증류수를 첨가합니다. PCR 반응의 5가지 요소: PCR 반응에는 주로 5가지 물질이 관여합니다. 즉, 프라이머, 효소, dNTP, 템플릿 및 버퍼(그 중 Mg2+ 필요)

이 섹션에서 PCR 반응 조건 선택을 편집하세요.

PCR 반응 조건은 온도, 시간 및 사이클 수입니다. 온도 및 시간 설정: PCR 원리의 3단계에 따라 변성, 어닐링, 신장의 3가지 온도 지점이 설정됩니다. 표준반응에서는 이중나선 DNA를 90~95°C에서 변성시킨 후 40~60°C로 급랭시킨 후 프라이머를 어닐링시켜 표적 서열에 결합시키는 3온도점법을 사용합니다. 그런 다음 Taq DNA에서 70-75°C로 빠르게 가열됩니다. 중합효소는 주형을 따라 프라이머 가닥을 확장합니다. 길이가 100~300bp인 짧은 표적 유전자의 경우에는 변성 온도 외에 어닐링 온도와 연장 온도를 하나로 결합하여 변성시키는 2온도점 방법을 사용할 수 있습니다. 어닐링 및 신장의 경우 65°C(이 온도 Taq DNase는 여전히 높은 촉매 활성을 가집니다). ① 변성 온도 및 시간: 변성 온도가 낮고 용융이 불완전한 것이 PCR 실패의 주요 원인입니다. 정상적인 상황에서는 93℃~94℃min이면 주형 DNA가 변성되기에 충분합니다. 93℃보다 낮을 경우 시간을 연장해야 하지만 고온 환경이 DNA에 영향을 미치기 때문에 온도를 너무 높여서는 안 됩니다. 효소의 활동.

이 단계에서 표적 유전자 템플릿이나 PCR 산물을 완전히 변성시킬 수 없으면 PCR 실패가 발생합니다. ② Annealing(renaturation) 온도 및 시간: Annealing 온도는 PCR 특이성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 변성 후 온도를 40~60°C로 빠르게 냉각하여 프라이머와 템플릿이 결합할 수 있도록 합니다. 주형 DNA는 프라이머보다 훨씬 더 복잡하기 때문에 주형의 상보 가닥 사이의 충돌보다 프라이머와 주형 사이의 충돌 결합 가능성이 훨씬 높습니다. 어닐링 온도와 시간은 프라이머의 길이, 염기 조성, 농도, 표적 서열의 길이에 따라 달라집니다. 20개의 뉴클레오티드가 있고 G+C 함량이 약 50%인 프라이머의 경우 55°C는 최적의 어닐링 온도를 선택하기 위한 이상적인 시작점입니다. 프라이머의 재생 온도는 다음 공식을 통해 적절한 온도를 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. Tm 값(용융 온도) = 4(G + C) + 2(A + T) 재생 온도 = Tm 값 - (5 ~ 10℃ ) Tm 값의 허용 범위 내에서 더 높은 복원 온도를 선택하면 프라이머와 템플릿 간의 비특이적 결합을 크게 줄이고 PCR 반응의 특이성을 향상시킬 수 있습니다. 재생 시간은 일반적으로 30~60초이며, 이는 프라이머가 주형에 완전히 결합하는 데 충분합니다. ③연장 온도 및 시간: Taq DNA 중합효소의 생물학적 활성: 70~80℃ 150 뉴클레오티드/S/효소 분자 70℃ 60 뉴클레오티드/S/효소 분자 55℃ 24 뉴클레오티드/S/효소 분자 90°C 이상에서는 DNA 합성이 거의 완료됨 불가능한. PCR 반응의 Extension 온도는 일반적으로 70~75°C 사이에서 선택되며, 일반적으로 사용되는 온도는 72°C입니다. 너무 높은 Extension 온도는 프라이머와 템플릿의 결합에 도움이 되지 않습니다. PCR 연장 반응의 시간은 증폭하려는 단편의 길이에 따라 결정될 수 있습니다. 일반적으로 1Kb 이내의 DNA 단편의 경우 연장 시간은 1분이면 충분합니다. 3~4kb의 표적 서열은 3~4분이 소요되며, 10kb의 증폭에는 15분까지 연장이 필요합니다. 연장 간격이 지나치게 길면 불특정 증폭 밴드가 나타날 수 있습니다. 저농도 템플릿의 증폭을 위해서는 확장 시간이 약간 길어야 합니다.

효소 및 농도에 대한 이 섹션 편집

현재 사용할 수 있는 Taq DNA 중합효소에는 두 가지 유형이 있습니다. 하나는 Thermus thermophilus에서 정제된 천연 효소이고 다른 하나는 유전자 조작 효소입니다. 대장균군 박테리아에 의해 합성됩니다. 일반적인 PCR 반응을 촉매하기 위해서는 약 2.5U의 효소가 필요합니다(총 반응량 100ul 기준). 농도가 너무 높으면 비특이적 증폭이 발생할 수 있으며, 농도가 너무 낮으면 효소의 양이 줄어듭니다. 합성제품이 줄어들게 됩니다. dNTP의 품질과 농도 dNTP의 품질과 농도는 PCR 증폭 효율과 밀접한 관련이 있습니다. dNTP 분말은 과립형이므로 부적절하게 보관하면 쉽게 생물학적 활성을 잃게 됩니다. dNTP 용액은 산성이므로 1M NaOH 또는 1M Tris를 사용하여 고농도로 준비해야 합니다. HCL완충액의 pH를 7.0~7.5로 조정하여 소량씩 나누어 -20°C에서 냉동보관한다. 여러 번 동결하고 해동하면 dNTP가 저하됩니다. PCR 반응에서 dNTP는 50~200umol/L여야 하며, 특히 4개의 dNTP의 농도는 동일해야 합니다(등몰 준비). 그중 하나의 농도가 다른 것과 다른 경우(더 높거나 더 낮음) 불일치를 유발합니다. 농도가 너무 낮으면 PCR 산물의 수율이 감소합니다. dNTP는 Mg2+와 결합하여 유리 Mg2+의 농도를 줄일 수 있습니다. 주형(표적 유전자) 핵산 주형 핵산의 정제량과 정도는 PCR의 성공 여부를 결정짓는 핵심 요소 중 하나입니다. 전통적인 DNA 정제 방법은 일반적으로 검체를 소화하고 처리하기 위해 SDS와 Proteinase K를 사용합니다. SDS의 주요 기능은 세포막의 지질과 단백질을 용해시켜 막 단백질을 용해시키고 세포막을 파괴하는 것입니다. SDS는 또한 단백질에 결합하여 단백질을 침전시킬 수 있습니다. 특히 DNA에 결합된 히스톤은 유기용매인 페놀과 클로로포름으로 추출되어 단백질과 기타 세포 성분을 제거하고, 핵산은 에탄올이나 이소프로판올로 침전됩니다. 추출된 핵산은 PCR 반응의 주형으로 사용될 수 있습니다. 일반적인 임상검사 검체의 경우 빠르고 쉬운 방법으로 세포를 용해하고, 병원체를 용해하고, 염색체 단백질을 소화 및 제거하여 표적 유전자를 유리시키고, 바로 PCR 증폭에 사용할 수 있습니다. RNA 템플릿 추출은 일반적으로 RNase가 RNA를 분해하는 것을 방지하기 위해 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 단백질 분해효소 K 방법을 사용합니다. Mg2+ 농도 Mg2+는 PCR 증폭의 특이성과 수율에 중요한 영향을 미칩니다. 일반적인 PCR 반응에서는 다양한 dNTP의 농도가 200umol/L일 때 적절한 Mg2+ 농도는 1.5~2.0mmol/L입니다. Mg2+의 농도가 너무 높으면 반응 특이성이 떨어지고 비특이적 증폭이 일어나며 농도가 너무 낮으면 Taq DNA Polymerase의 활성이 감소하여 반응 생성물이 감소합니다.

이 단락의 작업 단계 편집

PCR 반응의 기본 프로세스

표준 PCR 프로세스는 세 단계로 나뉩니다(그림 참조). 1. DNA 변성(90℃-96℃): 열의 작용으로 이중 가닥 DNA 주형이 수소 결합을 끊어 단일 가닥 DNA를 형성합니다. 2. 어닐링(재생)(40℃-65℃): 시스템 온도가 감소하고 프라이머가 DNA 주형에 결합하여 부분 이중 가닥을 형성합니다. 3. Extension(68°C~75°C): Taq 효소의 작용(72°C 부근에서 최적 활성)으로 dNTP를 원료로 사용하여 프라이머의 5' 말단 → 3' 말단에서 DNA 가닥에 상보적인 프라이머를 합성합니다. 변성, 어닐링 및 확장의 각 주기 후에 DNA 함량은 두 배로 늘어납니다.

요즘에는 일부 PCR의 증폭 영역이 매우 짧기 때문에 Taq 효소 활성이 최적이 아니더라도 짧은 시간 내에 복제가 완료될 수 있으므로 2단계 방법, 즉 어닐링(annealing)으로 변경할 수 있습니다. 60°C와 65°C 사이에서 신장과 신장이 동시에 수행되어 온도 상승 및 냉각 과정을 감소시키기 위해 반응 속도가 향상됩니다.

이 섹션의 주기 매개변수를 편집합니다.

1. 사전 변성(초기 변성). PCR의 성공을 위해서는 주형 DNA의 완전한 변성이 중요합니다. 일반적으로 95°C에서 3~5분간 가열합니다. 2. 프라이머 어닐링: 어닐링 온도는 일반적으로 실험적으로(경험) 결정해야 합니다. 어닐링 온도는 PCR의 특이성에 큰 영향을 미칩니다. 3. Primer Extension: Primer Extension은 일반적으로 72°C(Taq 효소의 최적 온도)에서 수행됩니다. 연장 시간은 증폭된 단편의 길이와 사용된 Taq 효소의 증폭 효율에 따라 달라집니다. 4. 주기의 변성 단계: 일반적으로 주기의 95°C 및 30초는 다양한 표적 DNA 서열을 완전히 변성시키는 데 충분합니다. 변성 시간이 너무 길면 효소 활성이 손상되고, 변성 시간이 너무 짧으면 불완전한 결과가 발생합니다. 증폭 실패로 쉽게 이어질 수 있는 표적 서열의 변성. 5. 주기 수: 대부분의 PCR에는 25~35주기가 포함되어 있습니다. 주기가 너무 많으면 쉽게 비특이적 증폭이 발생할 수 있습니다. 6. 최종 연장: 마지막 사이클 후 반응을 72°C에서 5~15분 동안 유지합니다. 프라이머 확장을 완료하고 단일 가닥 제품을 이중 가닥 제품으로 어닐링합니다. PCR-PCR 자주 묻는 질문

전기영동 검출 시간

일반적으로 48시간 이내입니다. 어떤 경우에는 당일 전기영동으로 가장 잘 검출됩니다. 시간이 지나면 밴딩 패턴이 불규칙해지거나 심지어 사라지기도 합니다. 위음성, 증폭된 밴드가 나타나지 않음 PCR 반응의 주요 측면은 ① 주형 핵산 준비, ② 프라이머 품질 및 특이성, ③ 효소 품질, ④ PCR 주기 조건입니다. 그 이유를 찾으려면 위의 링크에서 분석과 연구도 수행되어야 합니다. 템플릿: ① 템플릿에 불순물 단백질이 포함되어 있음, ② 템플릿에 Taq 효소 억제제가 포함되어 있음, ③ 템플릿의 단백질이 소화 및 제거되지 않음, 특히 염색체의 히스톤, ④ 템플릿 추출 및 준비 과정에서 너무 많은 양이 손실됨, 또는 페놀을 흡입했습니다. ⑤주형핵산은 완전히 변성되지 않았습니다. 효소와 프라이머의 품질이 좋을 때 증폭 밴드가 나타나지 않으면 검체의 분해 과정이나 주형 핵산 추출 과정에 문제가 있을 가능성이 높습니다. 따라서 효과적이고 안정적인 분해 용액이 필요합니다. 준비하고 절차를 정해야 하며 임의로 변경해서는 안 됩니다. 효소 불활성화: 새로운 효소를 교체하거나, 기존 효소와 새로운 효소를 동시에 사용하여 위음성이 효소 활성 손실 또는 불충분으로 인해 발생하는지 분석해야 합니다. Taq 효소 또는 에티듐 브로마이드가 때때로 잊혀진다는 점에 유의해야 합니다. 프라이머: 프라이머 품질, 프라이머 농도 및 두 프라이머의 농도가 대칭인지 여부는 PCR 실패 또는 불만족스러운 증폭 밴드 및 쉬운 확산의 일반적인 원인입니다. 일부 배치에서는 프라이머 합성 품질에 문제가 있습니다. 두 프라이머 중 하나는 농도가 높고 다른 하나는 농도가 낮아 비대칭 증폭 효율이 낮습니다. ① 좋은 프라이머 합성 단위를 선택합니다. ② 프라이머의 농도는 OD 값만 볼 것이 아니라, 아가로스겔 전기영동을 위한 프라이머 원액에도 주의해야 합니다. 예를 들어 두 프라이머 밴드의 밝기가 대략 동일해야 합니다. , 한 프라이머에는 밴드가 있고 다른 프라이머에는 밴드가 없습니다. 스트립의 경우 이때 PCR이 실패할 수 있으므로 프라이머 합성 장치와 협상을 통해 해결해야 합니다. 한 프라이머의 밝기가 높고 다른 프라이머의 밝기가 낮은 경우 프라이머를 희석할 때 농도의 균형을 맞추세요. ③ 프라이머는 동결과 해동이 반복되거나 냉장고에 장기간 보관할 경우 프라이머의 변질 및 변질이 발생할 수 있으므로 고농도, 소량으로 보관해야 합니다. ④프라이머 길이가 충분하지 않거나, 프라이머 사이에 이합체(dimer)가 생기는 등 프라이머 디자인이 불합리하다. Mg2+ 농도: Mg2+ 이온 농도는 PCR 증폭 효율에 큰 영향을 미칩니다. 농도가 너무 높으면 PCR 증폭의 특이성이 떨어질 수 있습니다. 농도가 너무 낮으면 PCR 증폭 수율에 영향을 미치고 심지어 PCR이 발생할 수도 있습니다. 증폭 밴드가 없으면 증폭이 실패합니다. 반응 부피의 변화: 일반적으로 PCR 증폭에 사용되는 부피는 20ul, 30ul, 50ul입니다. 또는 100ul는 과학적 연구나 임상시험의 목적에 따라 PCR 증폭에 어떤 용량을 사용해야 할지 정해져 있습니다. 20ul 등으로 작은 용량을 만든 후 큰 용량으로 만들면 조건을 따라야 합니다. 쉽게 실패합니다.

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PCR 증폭에는 변성이 매우 중요합니다. 변성 온도가 낮고 변성 시간이 짧을 경우 위음성이 발생할 가능성이 매우 높습니다. Annealing 온도가 너무 낮으면 비특이적 증폭이 발생하여 특이적 증폭 효율이 감소할 수 있습니다. 때로는 증폭기나 수용성 포트의 변성, 어닐링 및 확장 온도를 확인하기 위해 표준 온도계를 사용해야 하는 경우도 있습니다. 이는 PCR 실패의 원인 중 하나입니다. 표적 서열 변이: 표적 서열이 변이되거나 결실되어 프라이머와 주형의 특이적 결합에 영향을 주거나, 표적 서열의 특정 세그먼트가 결실되어 프라이머와 주형이 상보적인 서열을 상실한 경우, PCR 증폭 성공하지 못할 것입니다. 위양성으로 나타나는 PCR 증폭 밴드는 표적 서열 밴드와 일치하며 때로는 밴드가 더 질서 있고 밝습니다. 부적절한 프라이머 디자인: 선택된 증폭 서열이 비표적 증폭 서열과 상동성을 가지므로 PCR 증폭을 수행할 때 증폭된 PCR 산물이 비표적 서열입니다. 타겟 서열이 너무 짧거나 프라이머가 너무 짧으면 위양성이 쉽게 발생할 수 있습니다. 프라이머를 다시 디자인해야 합니다. 표적 서열 또는 증폭 산물의 교차 오염: 이 오염에는 두 가지 이유가 있습니다. 첫째, 전체 게놈 또는 큰 단편의 교차 오염으로 인해 위양성이 발생합니다. 이 잘못된 긍정은 다음 방법으로 해결할 수 있습니다. 대상 시퀀스가 ​​샘플 건으로 빨려 들어가거나 원심 분리기 튜브 밖으로 튀는 것을 방지하기 위해 작동할 때 주의하고 부드럽게 주의하십시오.

고온에 견디지 못하는 효소나 물질을 제외한 모든 시약이나 장비는 고압으로 멸균해야 한다. 모든 원심분리 튜브와 시료 주입 피펫 팁은 한 번만 사용해야 합니다. 필요한 경우, 존재하는 핵산을 파괴하기 위해 검체를 추가하기 전에 반응 튜브와 시약에 자외선을 조사합니다. 두 번째는 공기 중의 작은 핵산 조각의 오염입니다. 이 작은 조각은 표적 서열보다 짧지만 일정한 상동성을 가지고 있습니다. 이들은 서로 스플라이싱될 수 있으며, 프라이머에 상보적인 PCR 산물이 증폭되어 위양성(false positives)이 발생할 수 있으며, 이는 중첩된 PCR 방법에 의해 감소되거나 제거될 수 있습니다. 비특이적 증폭 밴드가 나타납니다. PCR 증폭 후 나타나는 밴드는 크든 작든 예상 크기와 일치하지 않거나, 특이적 증폭 밴드와 비특이적 증폭 밴드가 동시에 나타납니다. 비특이적 밴드가 나타나는 이유는 첫째, 프라이머가 표적 서열에 완전히 상보적이지 않거나 프라이머가 응집하여 이합체를 형성하기 때문입니다. 두 번째 이유는 Mg2+ 이온 농도가 너무 높고, 어닐링 온도가 너무 낮으며, PCR 사이클 수가 너무 높기 때문입니다. 두 번째 요인은 효소의 품질과 양입니다. 일부 소스의 효소는 종종 비특이적 밴드가 발생하는 경향이 있지만 다른 소스의 효소는 그렇지 않습니다. 대책에는 다음이 포함됩니다. 필요한 경우 프라이머를 재설계합니다. 효소의 양을 줄이거나 다른 소스로 교체하세요. 프라이머 양을 줄이고, 템플릿 양을 적절하게 늘리고, 주기 수를 줄이세요. 어닐링 온도를 적절하게 높이거나 2온도점법(93°C에서 변성, 65°C 부근에서 어닐링 및 신장)을 사용하십시오. 번진 밴드 또는 번진 밴드가 나타납니다. PCR 증폭에서는 때때로 번진 밴드, 시트 모양의 밴드 또는 카펫 같은 밴드가 나타납니다. 그 이유는 종종 효소가 너무 많거나 효소 품질이 좋지 않은 경우, dNTP 농도가 너무 높은 경우, Mg2+ 농도가 너무 높은 경우, 어닐링 온도가 너무 낮은 경우, 사이클이 너무 많은 경우 등이 있습니다. 대책에는 효소의 양을 줄이거나 효소를 다른 공급원으로 교체하는 것이 포함됩니다. ②dNTP의 농도를 줄입니다. Mg2+ 농도를 적절하게 줄입니다. 템플릿 양을 늘리고 주기 수를 줄이세요.

PCR 산물을 복제하려면 이 단락을 편집하세요

1) PCR 산물을 복제하기 위한 최적의 조건은 무엇입니까? 최적의 삽입:벡터 비율은 실험적으로 결정되어야 합니다. 1:1(삽입:벡터)이 최적의 비율인 경우가 많으며 1:8 또는 8:1의 몰 비율도 허용됩니다. 비율 범위를 결정해야 합니다. 2X ligation 용액 5ul, 플라스미드 DNA 50ng, T4 ligase 1 Weiss 유닛, insert 단편 10ul를 사용하세요. 실온에서 1시간 동안 배양하거나 4°C에서 밤새 배양합니다. 이 두 온도에서 T자형 돌출 끝이 없는 캐리어는 자체 연결되어 파란색 점을 생성합니다. 실온에서 1시간 배양하면 대부분의 클로닝 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 결찰 효율성을 높이려면 4°C에서 하룻밤을 보내야 합니다. 2) PCR 산물을 gel 정제해야 하나요? Gel로 분석한 증폭산물에 밴드가 1개만 있는 경우에는 Gel Purification을 사용할 필요가 없습니다. 만약 다른 이질적인 밴드가 보인다면 이는 다량의 프라이머가 축적된 이합체일 수 있습니다. 소량의 프라이머 이량체도 높은 몰량으로 존재하며, 이는 관심 삽입물이 아닌 프라이머 이량체를 갖는 높은 비율의 클론을 생성합니다. 이를 위해서는 클로닝 전에 젤 정제가 필요합니다. 3) 타겟 조각이 복구되지 않으면 어떤 대조 실험이 필요합니까? A) 형질전환되지 않은 수용성 세포를 코팅합니다. 콜로니가 있는 경우에는 암피실린이 효과가 없거나, 암피실린 내성 플라스미드에 오염되었거나, 암피실린 내성 콜로니를 생성한다는 의미입니다. B) 완전한 플라스미드를 변환하고, 콜로니 성장 수를 계산하고, 변환 효율을 결정합니다. 예를 들어, 1ug/ul 플라스미드를 1:100으로 희석하고 100ul 수용 세포의 형질전환에 1ul를 사용합니다. SOC로 1000ul로 희석한 후 100ul를 도금용으로 사용합니다. 밤새 배양하여 1,000개의 콜로니를 생성합니다. 전환율은 생산된 총 콜로니 수/도금된 DNA의 총량입니다. 도금된 DNA의 총량은 형질전환 반응에 사용된 양을 희석배수로 나눈 값입니다. 구체적으로는 형질전환용으로 10ng DNA를 사용하고, SOC로 1000u로 희석한 후 10ng DNA를 함유하고, 플레이팅용으로 1/10을 사용하고, 1ng DNA를 사용한다. 형질전환율 : 1000 clones 콜로니가 적고 수용세포의 형질전환율이 너무 낮습니다. C) pGEM-T 양성 대조군 또는 PCR 생성물이 >20-40개의 파란색 반점을 생성하는 경우(지정된 10단계(8승) cfu/ug 수용 세포 사용), 이는 벡터가 T를 상실했음을 나타냅니다. 리가아제가 뉴클레아제를 오염시킬 가능성이 있습니다. T4 DNA 리가아제(M1801, M1804, M1794)는 우수한 품질 표준을 갖고 있으며 뉴클레아제 오염이 없습니다. 다른 소스의 T4 DNA 리가아제로 교체하면 안 됩니다. D) pGEM-T 또는 pGEM-T Easy 벡터를 사용하고, pGEM-T 양성 대조군을 연결하고, 고주파 수용 세포(10(8승) cfu/ug)를 변환하여 60% 콜로니를 얻습니다. 그 중 흰 반점이 있어야 합니다. >20-40개의 파란색 반점이 생성되면 집락이 없거나 거의 없으며 연결 문제가 있는 것입니다. 4) 대조실험 결과는 좋았으나, 표적 단편이 회수되지 않았다. 실험에서 무엇이 잘못되었나? A) 라이게이션은 실온에서 1시간 동안 배양해야 하며, 이는 대부분의 클론에 충분하며 효율성을 높이려면 밤새 4°C에서 보관해야 합니다. B) 삽입된 단편이 오염되어 3`-T 결실이 발생하거나 결찰 및 변형이 억제됩니다. 이렇게 하려면 삽입물과 pGEM-T 양성 대조군을 혼합하고 결찰하십시오. 컨트롤의 콜로니 수가 감소하면 삽입물을 다시 정제하거나 준비해야 합니다. 파란색 반점이 많이 생성되면 삽입된 단편이 뉴클레아제로 오염되어 pGEM-T 또는 pGEM-T Easy 벡터에서 3`-T 결실이 발생하는 것입니다. C) 삽입된 단편이 ligation에 적합하지 않습니다.

과도한 UV 조사로 인해 젤 정제된 인서트가 자주 발생합니다. 과도한 UV 조사는 결찰에 도움이 되지 않는 피리미딘 이합체를 생성하므로 DNA를 다시 정제해야 합니다. D) 복구 기능을 갖는 내열성 DNA 중합효소의 증폭산물은 pGEM-T 또는 pGEM-T Easy 벡터 클로닝에 필요한 A가 말단에 존재하지 않습니다. Taq DNA 폴리머라제와 뉴클레오티드를 추가하여 끝에 A를 추가합니다. 자세한 내용은 pGEM-T pGEM-T Easy 벡터 기술정보(TM042)를 확인하세요. E) 반복성이 높은 서열은 증폭 과정에서 불안정할 수 있으며, 삽입된 단편에서 결실 및 재배열이 높은 빈도로 발생하는 것으로 확인되면 SURE 세포와 같은 재조합 결핍 대장균 균주에 대한 조치가 필요합니다. 사용됩니다.

이 PCR 반응의 분류를 편집

SOEing-PCR(overlap PCR)

겹침 영역 증폭 유전자 접합 방법은 일반적인 PCR 기술에서 파생된 효과적인 유전자 융합 및 부위 지정 돌연변이 유발 방법. 우리 모두 알고 있듯이 프라이머는 주형에 효과적으로 결합하기만 하면 되고, 특히 5'말단 서열은 주형과 완전히 짝을 이룰 필요가 없으므로 5'말단에 하나 또는 두 개의 효소 절단 부위를 추가할 수 있습니다. 나중에 클로닝을 용이하게 하기 위해 증폭 프라이머를 사용합니다. SOEing 방법은 두 유전자 사이의 중첩 영역 목적을 달성하기 위해 두 개의 독립적인 유전자에 새로운 서열을 통합하는 이러한 기능을 활용합니다. 3' 말단의 조합을 통해 유전자 융합 또는 부위 지정 돌연변이가 달성될 수 있습니다.

RT-PCR(역전사 PCR)

RT-PCR은 역전사 RCR(역전사 PCR)과 실시간 PCR(실시간 PCR)의 약어와 동일합니다. 역전사 PCR 또는 역전사-PCR(RT-PCR)은 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 널리 사용되는 변형입니다. RT-PCR에서는 RNA 가닥이 상보적인 DNA로 역전사되어 PCR을 통해 DNA를 증폭시키는 주형으로 사용됩니다.