분자 복제 - 예

소개: 심리스 클로닝 기술은 오늘날 가장 인기 있는 플라스미드 구축 기술이며 거의 모든 분자 생물학 실험실에서 사용됩니다. 이전에 Gibson Assembly의 실험 설계 및 작동 절차에 대해 자세히 설명했으므로 이번에는 또 다른 원활한 클로닝 방법인 Golden Gate Assembly를 소개하겠습니다. 이것이 귀하의 플라스미드 구축 실험에 도움이 되기를 바랍니다.

분자 복제라고 하면 플라스미드 제작을 해본 사람은 거의 다 아는 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly) 방식이에요! 처음 연구실에 들어왔을 때 선배들이 플라스미드를 만드는 데 사용하는 방법이 Gibson Assembly라고 가르쳤던 기억이 납니다. 고등학교 생물학 수업과 학부 생물학 수업에서 효소 결찰 방법은 오랫동안 유행하지 않았습니다. 나중에 많은 문헌을 읽어보니 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly) 외에도 실제로 유용한 플라스미드 구축 방법이 많이 있다는 것을 알게 되었는데, 깁슨 어셈블리와 거의 동시에 등장한 골든 게이트 어셈블리(Golden Gate Assembly)도 그 중 하나일 수 있습니다. 원활한 복제에 사용됩니다.

골든 게이트 어셈블리(Golden Gate Assembly)는 전통적인 효소 소화 결찰 방법과 다른 새로운 유형의 효소 소화 결찰 방법[1, 2]입니다. 전통적인 제한 효소 결찰 방법은 표준 유형 II 제한 효소(예: Eco RI)를 사용하여 DNA를 절단합니다. 이러한 제한 효소는 일반적으로 4~8 bp 회문 서열을 인식하고 인식된 서열 내에서 절단하여 끈적끈적한 말단 또는 둔한 말단을 생성합니다. (그림 1A). Golden Gate Assembly는 유형 IIS 제한 효소(예: Bsa I)를 사용하여 DNA를 절단합니다. 이러한 제한 효소는 비회문형 서열을 인식하고 인식 서열 외부를 절단하여 끈적끈적한 말단을 생성합니다(그림 1B).

그림 1 II형 제한효소와 IIS형 제한효소 절단 DNA

IIS형 제한효소 절단 DNA에 의해 생성되는 끈적끈적한 말단은 일반적으로 2개 염기 또는 4개 염기입니다. 라이게이션 반응에서는 끈적끈적한 말단에 염기가 많을수록 라이게이션 산물의 충실도가 높아집니다. 따라서 골든 게이트 어셈블리에서는 일반적으로 4염기 말단을 생성할 수 있는 IIS 제한 효소를 사용하는데 일반적으로 사용되는 것에는 Bsa I, Bsm BI가 있습니다. 및 BbsI(그림 2). NEB Company는 이 세 가지 야생형 제한 효소에 대해 분자 변형을 수행하여 인식 서열은 변하지 않지만 특이성은 더 강한 세 가지 제한 효소, 즉 Bsa I-HFv2, Bsm BI-v2 및 Bbs I-HF를 얻었습니다(그림 2). 이들 제한효소의 인식 서열 길이는 6bp이므로 DNA 서열에 나타날 확률은 1/4096이다.

그림 2 세 가지 유형의 IIS 제한 효소의 특이성

그림 2에서 볼 수 있듯이 세 가지 유형의 IIS 제한 효소의 특이성은 다음과 같이 기록할 수 있습니다. Bsa I(GGTCTC 1 /5), Bsm BI(CGTCTC 1/5), Bbs I(GAAGAC 2/6). 또한, 3-염기 끈적끈적 말단을 생성할 수 있는 IIS 유형 제한 효소 Sap I(GCTCTTC 1/4)도 일반적으로 사용됩니다[3]. ligation product 정도는 약간 낮겠지만 인식 서열의 길이가 더 길어서(7 bp) DNA 서열에 나타날 확률은 1/16384입니다. 서로 다른 절단 부위 서열에 따라 Bsa I, Bsm BI 및 Bbs I에 의해 생성될 수 있는 점착 말단 유형은 256가지이고, Sap I에 의해 생성될 수 있는 점착 말단 유형은 64가지입니다.

시중에는 Golden Gate Assembly를 기반으로 한 클로닝 키트가 많이 있지만 모두 비싸므로 반응 시스템을 준비하는 데 필요한 효소와 시약을 직접 구입하는 것이 좋습니다. Golden Gate Assembly의 작동 원리 및 실험 설계 방법에는 문제가 없습니다. 다음으로 Bsa I-HFv2를 예로 들어 Golden Gate Assembly를 사용하여 플라스미드를 구성하는 방법을 설명하겠습니다.

프라이머 디자인

PCR을 통해 Bsa I의 인식 서열을 도입하고, 제한 효소가 안정적으로 결합할 수 있도록 프라이머의 5' 말단에 인식 서열을 추가합니다. DNA 이중가닥에 결합하여 절단을 수행하려면 인식 서열 끝에 보호 염기를 추가해야 합니다. 보호 염기의 수와 유형은 고정되어 있지 않습니다. 프라이머 디자인을 단순화하기 위해 TTT를 보호 염기로 사용할 수 있습니다. (대부분의 제한 효소에는 3 bp의 보호 염기가 충분합니다. 보험 목적으로 보호 염기를 늘릴 수도 있습니다. 절단 부위는 인식 서열의 하류에 있고 임의의 서열일 수 있으므로 그림 3과 같이 3가지 서로 다른 프라이머 설계 방법이 있습니다.

그림 3 프라이머 설계를 위한 세 가지 전략: N은 임의의 염기를 나타내고, 1234와 5678은 두 개의 서로 다른 절단 부위를 나타냅니다. N과 절단 부위는 PCR 템플릿의 기존 서열을 사용하거나 프라이머를 통해 도입될 수 있습니다.

실험 원리

(1) 두 DNA 조각의 연결

그림 4 두 조각을 연결하는 골든 게이트 어셈블리

(2) DNA 조각의 연결 4개의 DNA 단편

그림 5 골든 게이트 어셈블리는 4개의 단편을 연결합니다: 1234, 5678, abcd 및 efgh는 4개의 서로 다른 절단 부위를 나타냅니다.

위의 두 그림은 2의 작동 원리를 보여줍니다. -세그먼트 연결과 4세그먼트 연결은 각각 다른 개수의 세그먼트 연결도 유사합니다. 효소 분해 및 결찰은 동일한 반응 시스템에서 수행됩니다. PCR 산물을 기질로 사용하거나(그림 4 및 그림 5) 먼저 PCR 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝한 다음 플라스미드를 기질로 사용할 수 있습니다. 적절한 실험 조건과 실험 설계 하에서 Golden Gate Assembly를 사용하면 20개 이상의 DNA 단편을 조립할 수 있습니다. 아래의 짧은 비디오는 Golden Gate Assembly의 작동 원리를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

골든 게이트 어셈블리의 작동 원리

작동 과정

(1) 반응 시스템 준비

① 삽입된 각 단편의 양 추가된 벡터의 양과 벡터 및 삽입 단편의 길이에 따라 변환할 수 있습니다. 변환 도구/#!/연결; ②다른 사용 가능한 엔도뉴클레아제: BsmBI-v2(NEB #R0739, 10U/?l), BbsI-HF(NEB #3539, 10U/?l), SapI(NEB #R0569,10U/?l) ③삽입된 단편의 수가 1~10이면 삽입된 단편의 수가 다음보다 크면 10개를 사용합니다. 10이면 20유닛을 사용하고, 삽입된 프래그먼트의 개수가 1~10이면 500유닛을 사용하고, 삽입된 프래그먼트의 개수가 10보다 크면 1000유닛을 사용합니다.

(2) 반응 프로그램

참고: BsaI-HFv2의 최적 반응 온도는 37°C입니다. 다른 제한 효소를 사용하는 경우 온도를 조정해야 할 수도 있습니다. BsmBI-v2로 최적 온도는 42℃입니다.

장점

전통적인 제한효소 연결과 비교

(1) IIS 제한효소 유형의 절단 부위는 인식 서열 외부에 있으므로 인식 서열은 다음과 같습니다. 효소 내의 효소는 절단 과정 중에 제거되며 결찰 생성물에 불필요한 서열을 도입하지 않습니다.

(2) 유형 IIS 제한 효소는 절단 부위의 순서에 대한 요구 사항이 없으므로 절단 부위의 순서를 설계하여 서로 다른 끈적한 말단을 생성할 수 있으므로 다중 단편의 방향성 조립이 가능해집니다.

(3) Ligation 생성물에 인식 서열이 남지 않기 때문에 효소 소화 반응과 Ligation 반응을 동일한 반응계에서 진행할 수 있어 실험 과정이 단순화된다.

Gibson Assembly와의 비교

(1) Fragment ligation 과정에는 서열 분해 및 합성이 포함되지 않으므로 Ligation 생성물의 충실도가 더 높습니다.

(2) 조립할 수 있는 DNA 단편의 수가 많아 플라스미드 라이브러리 구축에 적합합니다.

(3) 상동 서열이나 반복 서열을 가진 DNA 단편을 조립할 수 있습니다. 예를 들어, 여러 sgRNA를 발현하는 플라스미드를 구성하는 데 사용할 수 있습니다[4].

(4) BioBricks와 유사하게 표준화된 합성 생물학 구성 요소를 구성할 수 있습니다.

주의사항

(1) 적절한 제한효소를 선택해야 하며, 제한효소의 인식 서열이 최종 ligation 산물에 나타나서는 안 된다.

(2) 프라이머를 디자인할 때 인식 서열과 절단 부위의 방향이 정확해야 합니다.

(3) 삽입된 단편의 수가 많은 경우 연결의 특이성을 보장하기 위해 절단 부위의 4bp 서열을 합리적으로 설계해야 합니다.

참고문헌 [5]의 표 S7은 최적화된 절단 부위 서열 조합을 제공합니다.

참고문헌:

[1 ] Engler, C. , et al.(2008) PLoS One ?3, e3647.

높은 처리량 기능을 갖춘 원팟, 원스텝 정밀 복제 방법dx.doi.org

[2] Engler, C., et al.(2009) PLoS One ?4, e5553.

골든 게이트 셔플링: 유형 II 제한을 기반으로 한 원팟 DNA 셔플링 방법 Enzymesdx.doi .org

[3] Whitman, L., et al. Genet. Eng. Biotechnol. ?33, 42.

(PDF) Electra를 사용한 신속하고 흉터 없는 복제 Vector System.www.researchgate.net

[4] Vad-Nielsen, J., et al.(2016)?73, 4315–4325. p>https://doi.org/10.1007/s00018-016-2271-5doi.org

[5] HamediRad, M., et al.(2019)?8 , 1047–1054.

고효율 단일 포트 무스카리 Golden Gate Assemblydoi.org