사스의 병원체는?

“원인을 알 수 없는 전염병이 인류를 덮칠 때, 이에 대한 사람들의 반응은 미지의 것에 대한 인류의 두려움을 보여준다

”(미지의 전염병에 대한 공포는 전염병, 특히 전염병이 뚜렷한 원인 없이 발생하는 경우) [1]. 1977년에 에드워드 키예스(Edward Keyes)는 새롭게 등장한 재향군인병에 대한 대중의 공포를 설명하기 위해 이 문장을 사용했습니다. 이제 우리는 또한 병원체가 알려지지 않은 새로운 유형의 비정형 폐렴인 중증급성호흡기증후군(SARS)에 직면해 있습니다. 현재 사람들의 심리에 대한 설명에도 동일하게 적용 가능합니다. 일부 대중이 이 새로운 전염병에 대해 공포에 떨고 있다는 것은 부인할 수 없는 사실입니다. 이 공포의 일부는 병원체, 전염 방식, 병인, 병인 및 진단을 포함하여 새로운 질병에 대한 불완전한 이해 때문입니다. 치료와 예방에 대한 더 깊은 이해가 부족합니다. 그러나 다행스럽게도 인류는 사스에 대한 공동연구를 위해 국제적인 실험실 네트워크를 구성했다. 두 달도 채 되지 않아 관련 연구기관들이 병원체를 찾아내고 게놈 염기서열을 해독해 사스의 미스터리를 처음으로 밝혀냈다. 열렸습니다. 현재 전문가들은 약간의 진전을 이루었으며, 연구에 따르면 SARS 질병은 새로운 코로나바이러스와 관련이 있으며, 이 새로운 바이러스는 이전에는 인간이나 동물에서 발견되지 않았습니다. 전문가들은 이 질병에 대해 더 많은 알려지지 않은 사실을 계속 밝혀내고 있습니다. 연구진은 글로벌 협업을 통해 인터넷과 다양한 연구 방법을 활용해 단 두 달 만에 병원체를 동정했다. 20여년 전, 연구자들은 HIV 바이러스를 찾는 데 2년 이상을 보냈고, 그 후 그 뉴클레오티드 서열을 얻는 데 몇 년이 더 걸렸습니다. 반면 사스(SARS) 병원체 탐색에 대한 신속한 대응은 인상적이었다. 병원체를 발견하는 과정을 대략적으로 살펴보면 새로운 경험을 얻을 수 있고, 향후 연구의 기반을 마련할 수 있으며, 향후 발생할 수 있는 또 다른 전염병에 대한 경험을 제공할 수도 있을 것입니다.

연구 진행

1.1 사스 병원체 확인

2003년 3월 15일, WHO는 11개국의 실험실이 참여하는 국제 연구 네트워크를 구성했습니다. 우리 나라는

4월 초에 합류했습니다. 연구 네트워크의 진행은 대략 다음과 같습니다.

독일은 지난 3월 18일 전자현미경을 통해 인후 면봉 검체에서 파라믹소바이러스를 관찰한 것과 동시에 홍콩중문대학에서도 파라믹소바이러스의 유전자 증폭산물을 확보해 전자현미경 사진과 유전자를 홈페이지에 공개했다. 인터넷.순서.

싱가포르는 지난 3월 19일 환자 호흡기 검체에서 파라믹소바이러스 입자를 발견해 보다 약한 바이러스 유전자 증폭 제품(홍콩중문대학교에서 제공한 프라이머 기준)을 확보했다. 파라믹소바이러스를 세계 최초로 발견한 네덜란드 로테르담 연구소는 관련 환자로부터 검체를 확보했다.

3월 20일, 4개의 국제 실험실에서 파라믹소바이러스 검사를 시작했습니다. 네덜란드 로테르담 연구소는 파라믹소바이러스를 검출했으나 파라믹소바이러스 유전자 증폭은 음성이었다. 연구소는 검출 시약을 싱가포르와 홍콩에 보냈고, 캐나다 연구소는 로테르담에 이중 혈청을 보냈다.

3월 21일 홍콩 중문대학교 과학자들은 원숭이 신장 세포 배양 방법을 사용해 바이러스 분리물을 확보한 뒤 이에 상응하는 혈청학적 진단 시약을 개발했다. 많은 실험실의 연구 결과에 따르면 이 병원체는 인플루엔자 A 및 B 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 유형 1, 2, 3, 아데노바이러스, 라이노바이러스, 장내 바이러스, 인간 폐렴 바이러스, 마이코플라스마 폐렴과 같은 병원체와 관련이 없는 것으로 나타났습니다. , Chlamydia pneumoniae , 동시에 전자현미경으로 관찰한 결과 바이러스 입자는 50-60nm였습니다. 혈청 실험에서는 환자 혈청을 첨가하면 세포병변 효과를 억제할 수 있는 반면 대조군 혈청은 효과가 없다는 것이 입증되었습니다.

3월 21일 로테르담 연구소는 독일에 거주한 싱가포르인 환자 3명에게서 채취한 HMPV 바이러스 PCR

호흡기 검체에서 음성이라는 사실을 발견했습니다. 또한 베로세포와 원숭이 신장세포를 접종한 의심환자 2명의 호흡기 검체에서도 병변이 발견됐다. 또한 이날 영국 과학자들은 두 환자의 검체에서 H3N2 인플루엔자 바이러스를 테스트했는데, 중국 바이러스 전문가 홍타오(Hong Tao)는 클라미디아가 사스(SARS)를 일으키는 주요 병원체라고 발표했지만 클라미디아와 코로나바이러스의 동시 작용을 배제하지는 않았다.

3월 21일, 군의과학원 미생물학 및 전염병학 연구소의 Zhu Qingyu와 Qin Ede 연구원은 다양한 연구를 통해 SARS 환자의 부검 표본에서 코로나바이러스 유사 바이러스를 분리하는 데 성공했으며 다음과 같이 추론했습니다. SARS일 수도 있으며, 이 중요한 결과를 인민해방군 총물류부 보건부와 국가 보건부에 서면으로 보고했습니다.

3월 22일 홍콩 바이러스학 연구소 전자현미경으로 코로나바이러스 유사 입자(70nm)가 발견됐고, 태국 환자에게서 얻은 세포변성 제품에서도 코로나바이러스 유사 입자(70~100nm)가 발견됐다. 그러나 2개의 검체에서 HMPV 바이러스에 대한 동일한 PCR 양성 결과가 나왔습니다.

동시에 캐나다, 프랑스, ​​싱가포르 등에서는 파라믹소바이러스와 HMPV 바이러스를 검출하기 위해 PCR과 전자현미경 방법을 사용하기 시작했습니다. 캐나다는 20nm 바이러스 입자를 발견하고 HMPV 바이러스의 유전적 진화계통을 공개했습니다.

3월 23일 홍콩 바이러스 연구소는 검체 8개 중 2개가 코로나바이러스 RNA 양성 반응을 보였다는 사실을 발견했습니다. 미국은 홍콩 검체에서 코로나바이러스가 발견됐다고 보고하는 동시에 환자 혈청을 검출하는 면역형광법을 확립하고 코로나바이러스 유전자 증폭 프라이머를 인터넷에 공개했다. 비인두 면봉 샘플을 사용하여 기관지를 감염시키는 영장류 실험이 싱가포르와 홍콩에서 시작되었습니다. 캐나다와 프랑스는 각각 전자현미경과 PCR 기술을 이용해 코로나바이러스를 검출했다. 바이러스는 독일, 일본, 싱가포르의 Vero 세포에서 분리되었습니다. 영국 실험실에서는 의심되는 환자의 호흡기 및 소변 검체에서 닭 폐렴 바이러스 서열을 발견했습니다.

3월 24~26일 독일 연구소와 홍콩 연구소는 각각 전자현미경과 PCR 기술을 이용해 코로나바이러스를 검출했고, 독일 연구소는 바이러스 서열을 확보해 새로운 바이러스의 아미노산 서열을 확인했다. 독일, 네덜란드, 홍콩 등의 연구실에서는 더 많은 유전자 증폭 서열을 확보해 인터넷에 새로운 바이러스의 유전자 진화계통을 공개했다.

3월 27일부터 31일까지 원숭이를 실험대상으로 삼은 동물실험이 계속됐다. 홍콩과 미국의 실험실에서는 각각 정상 인간 혈청과 새로 분리된 바이러스가 음성인 것으로 확인됐다. 한편, 더 많은 실험실에서 코로나바이러스가 발견되었습니다. 일본은 싱가포르의 표본에서 양성 결과를 얻었습니다. 홍콩에서는 50명의 환자 혈청을 테스트했는데, 그 중 27명은 코로나바이러스 항체가 높았으며, 10명의 환자 대변 샘플에서도 5개의 샘플이 양성인 것으로 나타났습니다. 캐나다에서는 질병 발병 후 6~16일에 환자의 대변에서 바이러스 및 바이러스 유전자가 발견되었으며, 환자 표본에서는 인간 파라믹소바이러스가 발견되었습니다.

4월 1~8일 동물실험에서 파라믹소바이러스와 메타뉴모바이러스에 감염된 원숭이에서 임상증상이 나타났다.

미국 연구진은 질병 발병 20일 후 환자의 혈액에서 항체를 검출하기 위해 ELISA를 사용했다. 홍콩 연구진은 질병 발병 10일 후 환자의 혈청에서 IgM 항체를 검출하기 위해 면역형광법을 사용했습니다. 쥐 실험이 시작됩니다. 더 많은 실험실에서 Vero 배양 세포에서 코로나바이러스를 분리했으며, 일부 혈청학적 실험을 통해 SARS 질병이 파라믹소바이러스와 코로나바이러스의 복합 감염이라는 것이 확인되었습니다. 네덜란드, 독일, 홍콩, 미국은 코로나바이러스의 새로운 염기서열을 연속적으로 발견했고, 독일 과학자들은 표본에서 클라미디아를 발견했습니다.

4월 9일 중국 질병통제예방센터와 군의과학원 미생물 역학연구소는 군의과학원 관련 전문가에서 SARS 병원체 연구 심포지엄을 열었다. 양측에서는 클라미디아와 코로나바이러스에 대한 연구 진행상황을 각각 소개했다.

4월 10일 오후, 유명 바이러스 전문가이자 중국공정원 원사인 홍타오는 '사스 예방 및 예방에 관한 지식 소개 회의'에서 수십 개의 중국 및 해외 언론에 발표했다. Control": "SARS 병원체에 대한 연구 이 연구는 처음에 결과를 얻었으며 두 가지 주요 병원체, 즉 클라미디아와 코로나바이러스 유사 바이러스가 발견되었습니다."

4월 10일 신화통신에 따르면 중국 바이러스 질병 예방 통제 연구소의 리더신(Li Dexin) 교수, 비성리(Bi Shengli) 교수, 두안 슈민(Duan Shumin) 소장, 쉬원보(Xu Wenbo) 교수 등 과학 기술 인력이 참여했다. 중국 질병 통제 예방 센터는 SARS의 병원성 요인에 대해 보고했습니다. 과학 연구에서 중대한 진전이 이루어졌으며 여러 종류의 코로나 바이러스가 성공적으로 분리되었으며 분리된 코로나 바이러스 유전자의 일부가 복제되었습니다. 사스로 사망한 환자 3명의 폐 샘플과 그 중 1명의 비장 샘플에서 코로나바이러스를 검사한 뒤, 이 샘플에서 코로나바이러스 유전자를 정제·증폭하고, 증폭된 유전자를 뉴클레오티드 서열 결정을 통해 확인했기 때문이다. 코로나바이러스의 경우 분자생물학적 방법을 이용해 환자 장기에 코로나바이러스가 존재하는지 확인하는 것은 세계 최초로 이뤄졌다. 그들은 새로운 바이러스의 유전자 서열을 다른 코로나바이러스와 비교한 결과, SARS 환자에게 존재하는 코로나바이러스가 돌연변이 코로나바이러스라는 사실을 발견했습니다. 이들 검체를 이용해 다양한 세포를 배양한 결과, 신형 코로나바이러스는 성공적으로 분리됐다. 배양된 세포에서 바이러스가 여러 차례 계대됐고, 세포 병변이 안정적으로 나타났고, 바이러스 유전자 검사에서는 계속 양성이 나왔다. 국내 사스 환자의 목 면봉에서 3종의 코로나바이러스가 분리됐다. 이들 바이러스의 염기서열은 환자 장기에서 분리한 코로나바이러스와 동일하다. 지금까지 얻은 연구 결과는 코로나바이러스가 SARS를 유발하는 병원체일 수 있음을 상당 부분 나타냅니다.

4월 11일 신화통신은 군의과학원 미생물학 및 전염병학 연구소의 주칭위(Zhu Qingyu)와 친에더(Qin Ede) 연구원 2명의 연구 결과를 발표했습니다. 연구소는 지난 2월 말 사스(SARS) 환자의 부검 검체에서 코로나바이러스를 분리·동정했다. 3월 21일 현재, 혈청학, 면역학, 분자 생물학 및 기타 측면의 연구를 통해 코로나바이러스에 대한 추가 증거가 얻어졌습니다. 4월 9일, 분리된 4개의 코로나바이러스 균주의 서열이 결정되었습니다. 이 결과는 4월 16일에 발표되었습니다.

4월 12일, 캐나다 밴쿠버에 있는 브리티시 컬럼비아 암 연구소의 홀트 박사와 그의 연구팀은 의심되는 SARS 병원체의 게놈 서열을 공개했습니다.

4월 14일 애틀랜타 CDC의 앤더슨 박사 연구팀도 게놈 서열분석을 완료해 온라인에 공개했다.

두 연구그룹의 서열분석 결과는 기본적으로 일관됐다.

지난 4월 16일, 데이비드 하이먼 WHO 감염병 사무국장은 글로벌 과학연구자들의 공동 노력을 통해 변종 코로나바이러스가 사스를 유발하는 것으로 공식 확인됐다고 발표했다.

WHO는 지난 4월 17일 제네바에서 기자회견을 열고 병원체 동정의 마지막 단계를 완료했다고 발표했다.

이는 '코흐의 추정' 4단계다. ." 네덜란드 에라스무스 대학의 알베르트 오스터하우스 박사가 이끄는 연구팀은 실험용 원숭이를 신형 코로나바이러스에 감염시키는 데 성공했으며, 이후 감염된 원숭이로부터 바이러스를 분리해 실험실에서 배양했다. 이는 전 세계 과학자들이 한 달 간의 공동 노력 끝에 처음으로 SARS의 병원체를 식별했음을 보여줍니다[2-9].

4월 22일 중국은 사스(SARS)를 일으키는 코로나바이러스 지도를 공개했다[3][7][10].

1.2 SARS 바이러스 게놈 해독의 진전

1.2.1 캐나다 스미스 유전과학 센터

4월 12일 캐나다 과학자들은 SARS로 의심되는 유전자를 해독했습니다. 사스(SARS) 진단법 개발과 사스 백신 및 약물 개발이 첫 걸음을 내디뎠다.

밴쿠버에 있는 스미스 유전과학 센터(Smith Center for Genetic Sciences)는 SARS와의 전 세계적인 싸움에 동참합니다. 마라 센터 소장은 유전자 코딩은 과학자들이 진단 테스트 방법을 개발하는 데 필요한 기본 정보라고 말했습니다. 스미스 유전과학센터(Smith Genetic Science Center)는 유전자 코드를 해독한 후 즉시 이를 국제 네트워크(http://www.bcgsc.bc.ca)에 게시하여 전 세계 다른 과학자들이 사용할 수 있도록 했습니다.

1.2.2 홍콩대학교

홍콩대학교 미생물학과 원장 Yuen Kwok-yung은 홍콩대학교 의과대학이 콩은 사스(SARS)를 일으킨 코로나바이러스의 유전자 염기서열 분석을 완료해 신종 바이러스로 판단했다. 동물이 사람에게 전염시킨 것인지는 아직 연구 중이다. . Yuan Guoyong은 이번 발견이 현재의 신속한 테스트 방법을 개선하는 데 도움이 될 수 있다고 믿습니다. 앞서 홍콩중문대학교 연구진은 지난 13일 저녁 세계보건기구(WHO) 산하 '사스(SARS)' 실무그룹에 자신들이 해독한 신형 코로나바이러스의 일부 유전자 서열을 넘겨줬다.

1.2.3 미국 질병통제예방센터

4월 14일, 미국 질병통제예방센터는 SARS 바이러스에 대한 조사를 완료했다고 발표했습니다. 전 세계적인 전염병

신종 코로나바이러스 게놈 서열 분석을 담당하고 있습니다. 유전자 서열 분석 결과는 기본적으로 캐나다 실험실의 결과와 동일합니다. 두 기관의 시퀀싱 결과를 비교한 결과, 시퀀싱 결과에 15개의 추가 뉴클레오티드가 있다는 차이점이 발견되었으며, 이는 지속적인 시퀀싱 작업에 중요한 시작이 될 것입니다. 10명의 과학자와 많은 기술진의 공동 노력으로 12일간의 연구 끝에 시퀀싱 결과를 얻었다. 연구진은 사스 환자 1명의 인후 분비물을 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 배양해 질병을 일으킨 코로나바이러스의 핵산 서열을 정제한 뒤 증폭해 서열을 분석했다. 새로운 유전자 서열에는 29,727개의 뉴클레오시드가 있는데, 이는 코로나바이러스 계열의 전형적인 RNA 경계 내에 있으며, 일반적으로 코로나바이러스 계열 구성원의 경우 29,000~31,000개의 뉴클레오시드가 있습니다. 미국 질병 통제 예방 센터의 Julie Gerberding 박사는 새로운 바이러스의 유전자 서열을 결정하는 것이 질병의 치료와 예방 모두에 매우 중요하다고 말했습니다. 유전자 서열에 대한 정보를 사용하여 항바이러스제에 대한 실험실 연구가 시작될 수 있고, 백신 개발의 기초가 되며, 사례의 조기 발견을 위한 진단 테스트가 개발될 수 있습니다. 미국과 캐나다 연구에서 거의 동일한 결과가 중요하며, 샘플이 다른 국가에 감염된 다른 개인으로부터 수집되었기 때문에 바이러스가 동일한 출처에서 유래했을 수 있음을 시사합니다. 그러나 미국 질병통제예방센터 관계자는 코로나바이러스에 대한 분석이 아직 완료되지 않았다며, 연구자들은 세포 배양에서 분리한 바이러스와 SARS 환자의 바이러스를 비교해야 한다고 강조했습니다. , 수행된 유전자 서열 분석 작업은 비교 작업의 속도를 높일 것입니다.

1.2.4 중국 과학원 베이징 유전체학 연구소 및 군사 의학 아카데미 미생물 역학 연구소

중국 과학원 베이징 유전체학 연구소 미생물 역학 연구소와 군사 의학 아카데미가 협력하여 2003년 4월 16일 다양한 SARS 사례에서 분리된 4종의 코로나바이러스 균주에 대한 게놈 해독이 완료되었습니다. 그 결과 이 ​​바이러스의 길이는 약 30,000 염기쌍으로 캐나다와 미국에서 보고된 서열과 기본적으로 일치하는 것으로 나타났습니다. 캐나다 과학자들이 코로나바이러스 유전자를 해독했다고 발표했습니다.

코로나바이러스 전체 게놈 서열의 성공적인 결정은 코로나바이러스의 근원을 추적하고 SARS에 대한 진단 제제, 백신 및 치료제 개발을 위한 견고한 기반을 마련했으며, 국내에서 SARS 예방 및 치료에 중요한 진전을 이루었습니다. 내 조국 [ 2][3][4][5][8][10].

2 연구원들은 병원체를 분리하고 식별했습니다

전 세계 관련 실험실의 이번 병원체 공동 검색에서 홍콩 연구원들은 전통적인 바이러스 문화를 사용하여 획기적인 발전을 이루었습니다. 혈청학적 검출 기술과 현대 분자유전학적 방법으로 50명의 SARS 환자에게서 새로운 코로나바이러스인 병원체를 식별했습니다. 또한, 대조군의 샘플 분석은 병원체에 대한 그들의 주장을 더욱 뒷받침했습니다. 다른 호흡기 질환 환자의 호흡기 샘플 40개 중에서 헌혈자에 대한 새로운 코로나바이러스의 RNA를 포함하는 샘플은 단 하나도 발견되지 않았습니다. 200개의 혈청 샘플에는 바이러스에 대한 항체가 포함되어 있었습니다.

이러한 발견은 또한 미국 질병통제예방센터(CDC)와 캐나다 토론토의 관련 연구 기관 두 곳이 제시한 견해를 뒷받침하며, 이 새로운 코로나바이러스를 SARS 환자로부터 분리했습니다. , 바이러스가 SARS 발병과 관련이 있다고 믿습니다. 독일 연구자들은 처음 3명의 환자에게서 새로운 코로나바이러스를 발견했고, 테스트와 분석을 위해 베트남 하노이의 환자들로부터 추가 샘플을 수집했습니다. 결과도 이러한 결론을 뒷받침합니다.

2.1 국제 실험실 네트워크의 연구 결과

2.1.1 중국 홍콩

대한민국 미생물학과 페이리스 교수 연구팀 홍콩대학교가 홍콩에서 환자를 대상으로 연구를 진행해 병원체를 찾기 위한 연구를 진행했다

.

팀은 개정된 WHO 정의를 충족하는 사스 환자 50명을 선정해 홍콩 내 3개 응급병원에 입원했고, 모든 환자로부터 인후 면봉 샘플과 혈청 샘플을 채취해 일부 환자를 선정했다. 혈청 및 배설물 샘플은 각각 중증 및 회복기에서 수집되었습니다. 또한 환자의 폐 조직 샘플을 확보하고 바이러스 배양 분리, 역전사 PCR(RT-PCR), 기존 조직 방사선 촬영 및 전자 현미경 검사를 실시했습니다. 다른 환자의 인후 면봉 샘플, 배설물 및 혈청 샘플의 미생물학적 검사 결과가 대조군으로 사용되었습니다.

연구원들은 초기에 일상적인 혈액 검사, 생화학적 검사, 미생물학적 검사를 실시했고, 급속형광항원 면봉 샘플은 각각 혈액 샘플과 인후 면봉 샘플에 대해 세균 배양과 혈청학적 테스트를 실시했다. 병원체가 일반적인 호흡기 감염 바이러스인지 여부를 확인하기 위한 검사, 다양한 세포를 배양하여 병원체를 분리하는 임상 검체를 사용하여 직접 RT -PCR을 수행하여 인플루엔자 A 바이러스 및 인간 파라믹소바이러스 감염을 검출합니다. 또한 클라미디아의 존재를 검출하기 위해 배양된 세포에 ELISA 방법을 사용했습니다.

연구의 획기적인 점은 환자 2명의 샘플에서 코로나바이러스 유사 입자가 관찰된 것이다. 샘플 중 하나는 53세 남성 환자의 인후 면봉 샘플, 폐 생검 및 기타 샘플에서 코로나바이러스 RNA가 검출되었습니다.

바이러스 항체 역가가 크게 증가했습니다( 1/200~1/1600). 또 다른 샘플은 42세 여성 환자에게서 채취한 것으로 PCR 검사 결과 코로나바이러스 양성이 나왔고, 자신의 혈청 항체도 변화(1/150~1/1600)됐다.

연구원들이 두 시료에 배양세포를 접종한 지 2~4일 후 원형굴절성 질환 세포가 나타나 병원체 분리가 있었고, 분리된 병원체는 인식되지 않은 것으로 나타났다. . 일반적인 바이러스에 대한 시약 플레이트 반응. 세포배양추출물을

42

고속 원심분리한 후 전자현미경으로 음성염색을 관찰한 결과 외피가 있는 바이러스가 불규칙한 형태를 띠고 있는 것을 확인하였다. 직경 80~90나노미터 정도. 테이블

얼굴 생김새가 코로나바이러스와 비슷하다. 감염된 세포의 매우 얇은 부분을 전자현미경으로 관찰한 결과 세포질과 세포막 표면에 유사한 바이러스 입자가 존재하는 것으로 나타났으며, 두 환자에게서 분리된 바이러스는 크기와 형태학적 특성이 매우 유사했습니다.

신규 분리된 바이러스의 유전자 서열 정보를 얻기 위해 연구진은 무작위 RT-PCR을 실시한 후 바이러스 감염 세포의 특징적인 염색체 밴드를 클로닝하고 서열 분석했다

, 그리고 GenBank에서 데이터베이스를 분석한 결과, 상동 서열을 비교한 결과, 테스트한 30개 클론에서 알려지지 않은 서열이 발견된 것으로 나타났습니다. 이 DNA 서열을 분석한 결과 코로나바이러스와 낮은 상동성이 있는 것으로 나타났으나, 이를 통해 추론된 아미노산 서열은 코로나비리대 계열의 소 코로나바이러스 및 쥐 폐렴 바이러스 RNA 폴리머라제와 높은 상동성을 갖는 것으로 나타났습니다(57%). >단백질 서열의 계통발생학적 연구에 따르면, 새로운 바이러스는 코로나바이러스 그룹2와 높은 관련성을 갖고 있는 것으로 나타났습니다. 바이러스 혈청학적 반응을 측정하기 위해 간접 면역형광 검출법을 사용했습니다.

그 결과, 중증 및 회복기 환자 32명 모두에서 혈청전환이 발생하여 바이러스 항체 역가가 증가하는 현상이 나타났습니다.

연구팀은 인간 파라믹소바이러스에 대해서도 RT-PCR과 혈청항체역가검사를 실시한 결과 음성으로 나왔고, 다른 병원체도 검출되지 않았다

. 따라서 연구팀은 분리된 코로나바이러스가 SARS의 병원체 또는 필수인자로 보고 있으나, 다른 미생물 또는 비미생물 보조인자가 역할을 하는지는 아직 밝혀지지 않았다[11][12].

2.1.2 독일

사스의 초기 발병은 아시아에서 발생했으며, 아시아에서 대륙 간 여행으로 인해 질병이 다른 대륙으로 퍼졌습니다. SARS 질병은

새로운 질병이고 인간이 원인 물질에 대해 전혀 모른다는 점을 감안할 때 초기 연구 노력은 원인 물질을 식별하는 데 집중되었습니다.

WHO는 사스의 병원체를 찾기 위해 관련 국가의 연구 노력을 집중하기 위해 국제 실험실 네트워크를 구성했습니다. 네트워크에 속한 독일 연구기관에서도 병원체 식별에 관한 연구를 진행하고 있다.

연구팀은 처음에 같은 가족의 세 사람, 즉 32세 남성 환자와 그의 아내, 시어머니로부터 샘플을 선택했습니다.

그 남자는 SARS 환자를 치료한 싱가포르 의사였으며 이후 그의 아내와 시어머니를 감염시켰습니다. 세 사람은 어떤 이유에서인지 싱가포르에서 미국으로 왔고, 의사는 미국에 있는 동안 증상을 보였으며, 동료는 이를 WHO에 보고했고, 동료는 비행기를 타고 싱가포르 역으로 이송했습니다. —

프랑크푸르트는 그들을 격리했습니다. 관련 독일 연구자들은 호흡기 샘플과 혈액 샘플을 확보한 후, 팀은 또한 아시아에서 SARS 의심 또는 가능성이 있는 사례 18건과 SARS에 노출된 21명의 사례로부터 샘플을 확보했습니다.

환자는 있지만 감염자는 아니다.

연구원들은 우선 위 환자 3명의 검체에 대해 PCR 검사를 실시해 폐렴구균, 폐렴클라미디아, 인간 사이토메갈로바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 인간 파라믹소바이러스, 라이노바이러스, 인간 코로나바이러스의 존재 여부를 확인했다.

OC43 및 229E 유형과 같은 알려진 호흡기 병원체; 호흡기 샘플에 대한 항원 ELISA를 수행하여 폐렴구균, 인플루엔자 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스의 존재를 검출하고 혈청학적 검사를 수행했습니다. 혈액 샘플에 대해서도

전자현미경 관찰을 위해 호흡기 샘플과 혈액 샘플에 음성 염색을 했고, 샘플에 배양된 세포를 접종했습니다.

연구원들은 객담 샘플에서 RNA를 추출해 무작위 RT-PCR 기술로 분석했다.

설계된 PCR 프라이머 중 일부에는 축퇴 부위가 포함되어 있었고, 대부분의 프라이머는 3' 말단에 있었다. T 염기이기 때문에 프라이머 끝의 염기가 완전히 일치하지 않아도 DNA 중합효소가 작용할 수 있습니다. BLAST 도구를 사용하여 클론 증폭 산물의 상동성을 비교했습니다.

연구팀은 환자 3명의 검체를 대상으로 여러 차례 검사를 실시한 결과, 알려진 호흡기 병원체에 대한 검사 결과는 대부분 음성이었다.

호흡기 검체를 전자현미경으로 관찰한 결과, 파라믹소바이러스 유사 입자는 드물었지만 파라믹소바이러스 계열에 대한 여러 후속 PCR 테스트에서는 음성이 나왔습니다. 연구진은 객담 샘플에 배양된 세포를 접종한 지 6일 만에 배양액에 병든 세포가 존재한다는 사실을 발견한 뒤 RNA 추출을 실시하고 추출된 RNA에 대해 RT-PCR을 실시해 약 20개의 클론을 증폭 및 클로닝했다. >

다른 DNA 단편. 이들 단편의 서열을 분석하고 BLAST로 검색한 결과, 새로운 단편 3개가 데이터베이스의 서열과 일치하지 않았지만, 새로운 단편에서 추론된 것으로 결정되었습니다. 조각은 코로나바이러스 계열과 상동성을 보여 새로운 코로나바이러스가 분리되었음을 나타냅니다. 연구진은 새로운 단편을 미국 질병통제예방센터(CDC)가 측정한 새로운 바이러스 핵산 서열과 비교한 결과 상동성을 발견했다. 항체의 존재를 확인하기 위해 이 세 환자의 혈청 샘플과 감염된 배양 세포에 대해 면역형광 검사를 수행했습니다. 두 명의 환자의 혈청에서 상승된 IgG 항체가 검출되었는데, 이는 새로운 코로나바이러스에 대한 혈청학적 반응이 있음을 나타냅니다.

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새로운 바이러스가 SARS와 관련이 있는지 테스트하기 위해 연구원들은 SARS 가능성이 있거나 의심되는 환자와 접촉한 사람들로부터 데이터를 추가로 수집했습니다.

그러나 감염되지 않은 사람의 검체(추가로 수집한 검체는 모두 베트남 하노이 출신), 이 검체 배치에 대해 중첩 PCR 분석을 실시한 결과 사스 가능성이 있는 사례에서 발견된 바이러스의 비율이 100%로 나타났습니다. 의심 사례의 23%, 그러나 건강한 접촉자에서는 바이러스가 발견되지 않았습니다. 이 데이터는 신형 코로나바이러스와 SARS 사이의 연관성을 추가로 입증할 수 있습니다.

연구팀은 파라믹소바이러스와 폐렴구균도 검출했지만, 이후의 표적 PCR 실험에서는 음성이 나왔다.

클라미디아 감염은 여러 환자에서 발견되었지만 다른 SARS 환자에서는 발견되지 않았습니다. 따라서 연구자들은 이러한 병원체가 SARS 질병의 원인 인자로 작용하는지, 공동 유발 인자로 작용하는지 여전히 불분명합니다[13].

2.1.3 미국

미국 질병 통제 예방 센터(CDC)는 WHO가 조직한 국제 실험실 네트워크의 연구 기관 중 하나입니다.

사스(SARS) 병원체 동정도 시작됐다. CDC 샘플은 베트남, 싱가포르, 태국, 캐나다, 홍콩, 대만, 미국의 SARS 환자로부터 채취되었으며, 알려진 일련의 병원체로부터 전염병의 원인을 식별하기 위해 노력했습니다.

출처 사스 발생.

SARS 환자의 임상 증상은 비특이적이기 때문에 초기 연구는 알려진 호흡기 병원체에 대한 조사에 중점을 두고 있으며

검출 방법을 조합하여 사용하고 있습니다. 연구진은 혈액, 혈청, 비인두 면봉, 기침액, 장기 조직 등 다양한 샘플을 수집하여 다양한 세포에서 배양한 후 젖먹이 쥐에 주입하여 배양된 병원균을 분리했습니다.

항체를 검출하기 위해 혈청 샘플에 대한 혈청학적 실험을 수행하고, 다음과 같은 분자 생물학 기술을 수행했습니다. PCR

, RT-PCR도 사용되었으며 예르시니아, 마이코플라스마, 클라미디아, 리케차, 레지오넬라, 인플루엔자 바이러스 유형 A 및 B와 같은 다양한 호흡기 병원균을 스크리닝했습니다. 파라인플루엔자 바이러스 계열 등

이 연구의 획기적인 성과는 전자현미경을 통해 코로나바이러스 유사 입자를 관찰한 것이다. 환자의 호흡기 샘플을 접종한 배양 세포는 질병에 걸린 세포로 매우 얇은 절편을 만들어 전자현미경으로 관찰한 결과, 질병에 걸린 세포와 세포막에서 약 80개 정도의 세포변성 효과가 나타났습니다. -직경 140nm, 바이러스 표면에 20~40nm의 복잡한 구조적 돌출부가 있음.

전자현미경을 이용해 환자의 기관지 세척액 샘플을 관찰한 결과 다수의 감염된 세포에도 코로나바이러스가 존재하는 것으로 나타났다.

연구원들은 새로운 바이러스 서열을 증폭시키기 위해 질병에 걸린 세포에 대해 RNA 추출과 RT-PCR을 수행했으며, 프라이머는 GenBank에 알려진 코로나 바이러스의 서열 정보를 기반으로 설계되었습니다.

증폭된 정제 산물은 공개된 코로나바이러스 서열과 비교하여 서열을 분석하고, 생물정보학 기술을 사용하여 분석하여 바이러스의 진화계통을 얻었습니다. 신형 바이러스의 서열을 다른 코로나바이러스와 비교하고, 그 서열에서 유추된 아미노산 서열을 비교한 결과, 신형 바이러스는 코로나바이러스 계열군2과 높은 상동성을 갖는 것으로 나타났다2

. 그러나 진화계통을 분석한 결과 이 ​​바이러스는 다른 코로나바이러스와 유전적으로 다른 것으로 나타나 분리된 바이러스가 새로운 유형의 코로나바이러스임을 나타냅니다. 검체에 대한 혈청학적 검사 결과, 감염된 세포 절편이 회복기 사스 의심 환자의 혈청과 반응한 것으로 나타났다

홍콩, 방콕, 미국 사스 의심 환자의 혈청에서 특이 반응이 나타났다

간접 형광 항체 실험에서 음성에서 양성으로의 전환 또는 반응성 증가를 나타내는 반응은 동일한 배치의 혈청 샘플에 대해 수행되었으며 회복 단계 샘플의 반응은 매우 특이했습니다. 항체가도 점차 증가했다.

샘플을 접종하고 배양된 세포에서 병원체를 증폭시킨 후 전자현미경 관찰을 통해 해당 병원체가 코로나바이러스라는 사실이 밝혀졌습니다. 분자생물학 연구를 통해 새로운 바이러스의 필수 특성이 추가로 확인되었습니다. 따라서 연구진은 분리된 신형 코로나바이러스가 사스(SARS)의 병원체일 수 있다고 믿고 있다. 그러나 연구팀은 병리학적 과정에서 환자의 병변 조직 세포에서 신형 코로나바이러스 항원이나 바이러스 RNA가 직접 검출되지 않았다는 점도 지적했다. 동시에, 모든 SARS 환자에게 새로운 바이러스가 존재한다고 확인할 수는 없으며, 일부 SARS 환자에서는 코로나바이러스가 검출되지 않았으므로 추가적인 관련 연구가 필요하다[14][15].

2.1.4 캐나다

캐나다 국립 미생물학 연구소 및 관련 연구 기관은 SARS 질병에 대한 연구를 수행하기 위해 SARS 연구팀을 구성했습니다.

추가 조사 결과, 연구진은 국내 최초의 사스 환자가 홍콩을 여행한 후 그곳에서 감염된 것으로 확인했습니다.

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환자가 홍콩으로 돌아왔습니다. 캐나다와 SARS 질병을 국가에 퍼뜨립니다. 연구진이 확보한 샘플은 환자(사망)에 의해 직접 또는 간접적으로 감염된 9명의 환자로부터 채취되었습니다. 연구진은 부검 조직 샘플 1개에 대한 조직병리학적 검사와 9명의 환자 모두의 샘플에 대한 미생물학적 테스트를 수행했습니다.

인플루엔자 바이러스 A 및 B, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 한타바이러스, 홍역 바이러스, 장내 바이러스, 리케차뿐만 아니라 플라비바이러스와 같은 알려진 모든 일반적인 바이러스의 존재를 검출하기 위해 부검 조직 샘플에 대해 면역조직화학을 수행했습니다. , 마이코플라스마 폐렴, 클라미디아 폐렴, 예르시니아 등.

모든 검사 결과는 음성이었습니다. 9명의 환자의 혈액검체, 호흡기검체, 소변검체에 대해 정기적인 세균 및 진균검사를 실시하였고, 이들 검체를 배양한 결과 레지오넬라균에 대한 특별검사도 음성으로 나타났습니다.

연구원들은 호흡기 시료에서 일반세균에 대한 분자생물학적 검사를 진행하고, DNA를 추출했으며, 일반 폐렴, 예르시니아, 클라미디아 등의 미생물에 대해서도 검사를 진행한 RT-PCR 결과도 있다. 음성을 보였다. 연구진은 일반 바이러스 검출도 실시했으며, 전자현미경과 직접형광검사 등 9명의 환자의 모든 호흡기 검체와 대변 검체를 대상으로 일상적인 직접 바이러스 검출을 실시한 결과 인플루엔자 바이러스 A와 B가 검출됐다. 검체에서는 파라인플루엔자바이러스 1·2·3종, 아데노바이러스, 호흡기세포융합바이러스 등이 검출되지 않았다. 마찬가지로, 일반적인 호흡기 바이러스에 대해서도 연구자들은 바이러스에 대한 분자 생물학 테스트를 실시했으며 대부분의 테스트 결과는 음성으로 나타났으나 기관지 세정액 샘플과

인후 면봉에서는 Nested RT- 샘플에 대한 PCR을 통해 인간 파라믹소바이러스가 확인되었으며 실험실 교차 감염 가능성이 배제되었습니다.

또한, 신형 코로나바이러스는 호흡기 검체를 접종한 배양세포에서 분리됐고, 사스 환자 9명 중 5명의 검체에서도 분리됐고, 파라믹소바이러스는 4명의 환자 검체에서 분리됐다. . 지금까지 연구기관과 홍콩 연구팀, 미국 CDC 연구진은 모두 사스 환자로부터 신형 코로나바이러스가 분리됐다고 보고했다. 이어 연구진은 새로운 바이러스에 대해 RT-PCR을 실시해 바이러스의 염기서열을 증폭, 클로닝한 뒤 염기서열을 분석한 뒤, 생명정보학 기술을 활용해 염기서열 분석 결과를 분석했다.

그러나 이 서열에서 추론된 아미노산 서열은 알려진 여러 코로나바이러스의 아미노산 서열과 높은 상동성(78%)을 가지고 있습니다.

생물학적 진화계통 새로운 바이러스 분석에 따르면 새로운 바이러스는 알려진 코로나바이러스 계열(그룹 1, 그룹 2, 그룹 3)과 그다지 유사하지 않은 것으로 나타났습니다.

연구원들은 기존 연구 결과를 바탕으로 분리된 인간 파라믹소바이러스와 신형 코로나바이러스 모두 사스병과 연관이 있을 수 있다는 결론을 내렸으나, 복합적인 것인지는 아직 명확하지 않다. 두 가지 바이러스 중 단독으로 작용하는 바이러스, 또는 검출되지 않은 다른 바이러스가 작용하는 경우, 이를 확인하기 위한 추가 연구가 필요합니다[16].

2.2 중국

중국질병통제예방센터 바이러스예방통제연구소 홍타오 교수가 이끄는 연구팀은 사스의 병원체에 대해 연구를 진행했다

전자현미경을 통해 관찰한 결과, 사스(SARS) 환자의 부검 검체에서 클라미디아와 코로나바이러스 입자가 발견됐으며, 연구 결과가 중국의학저널(China Journal of Medicine)에 게재됐다.

연구팀이 선정한 샘플은 사스로 사망한 7명의 환자에게서 채취한 것이며, 연구진은 사망자의 장기에서 장기 샘플을 채취해 전자현미경 표본과 병리학적 표본을 준비했다. 사망자 7명 중 광둥성 출신이 4명, 산시성 출신이 1명, 베이징 출신이 1명, 청두에서 사망한 홍콩 환자가 1명으로 매우 대표적이다.

병원체를 분리하기 위해 환자의 폐조직 추출물을 293세포(인간배아신장 형질전환 세포주)에 접종하고 환자의 조직과 분리된 병원체를 면역학적으로 동정하여 채취하였다

간접면역형광검사와 면역조직화학검사를 실시했습니다