단백질의 분리 방법은 무엇입니까? 단백질의 성질이나 특징은 무엇입니까?

묽은 소금과 완충체계의 수용액은 단백질을 추출하는 데 가장 많이 사용되는 용제이다. 왜냐하면 그것들은 단백질의 안정성이 좋고 용해도가 높기 때문이다. 보통 사용량은 원료 부피의 65,438+0-5 배입니다. 추출 시 단백질 용해에 도움이 되도록 골고루 섞어야 한다. 추출 온도는 활성 성분의 성질에 달려 있다. 한편, 대부분의 단백질의 용해도는 온도가 높아지면서 증가하므로 고온은 용해에 유리하고 추출 시간이 단축된다. 반면에, 온도가 높아지면, 단백질은 변성하여 비활성화될 수 있다. 따라서 이 점을 근거로 단백질과 효소의 추출은 일반적으로 저온 (5 C 이하) 에서 이루어진다. 단백질 추출 과정에서 분해를 피하기 위해 단백질 효소 억제제 (예: 인산이 이소 프로필 에스테르, 요오드 아세트산) 를 첨가할 수 있다.

다음은 추출액의 pH 값과 소금 농도 선택에 중점을 둡니다.

1, pH 값

단백질, 효소는 양성전해질로 등전점이 있고 추출액의 pH 값은 등전점 양쪽의 pH 값으로 선택해야 한다.

범위. 묽은 산이나 묽은 염기로 추출할 때 단백질 분해기단이 과산이나 과염기로 인해 변하는 것을 방지하여 단백질 구상에 돌이킬 수 없는 변화가 일어나는 것을 방지해야 한다. 일반적으로 알칼리성 단백질은 미산성 추출액으로 추출하고, 산성 단백질은 미알칼리성 추출액으로 추출한다.

2. 소금 농도 포함

희석 농축은 단백질의 용해를 촉진시킬 수 있는데, 이를 소금 용해라고 한다. 동시에, 소금 이온과 단백질의 결합으로 인해, 묽은 소금 용액은 단백질의 불변성을 보호하는 장점을 가지고 있다. 따라서 추출액에 NaCl 과 같은 소량의 중성염을 첨가하면 농도는 일반적으로 0.1.5MOL 이고 버퍼액은 보통 0.02-0.05M 인 인산염과 탄산염이다.

(2) 유기 용매 추출

지질과 밀접하게 결합하거나 분자에 더 많은 비극성 측쇄를 함유하고 있는 단백질과 효소는 물, 묽은 소금 용액, 희산 또는 묽은 염기에 용해되지 않는다. 에탄올, 아세톤, 부탄올과 같은 유기 용제를 사용할 수 있습니다. 그들은 일정한 친수성과 비교적 강한 친지성을 가지고 있어 지단백질의 이상적인 추출 용액이다. 그러나 저온에서 작동해야 합니다. 부탄올 추출 방법은 지질과 밀접하게 결합된 단백질과 효소를 추출하는 데 특히 유리하다. 우선, 부탄올은 특히 용해에 강한 친지성을 가지고 있다. 둘째, 부탄올은 친수성이 있어 용해도 범위 (10% 와 40 C 의 도는 6.6%) 에서 효소의 변성과 비활성화를 일으키지 않는다. 또한 부탄올 추출 방법은 넓은 pH 와 온도 범위를 가지며 동물, 식물 및 미생물 재료에도 적용됩니다.

둘째, 단백질의 분리 및 정제

단백질의 분리 순화 방법은 여러 가지가 있는데, 주로 다음을 포함한다.

(a) 단백질 용해도에 따라 다른 분리 방법.

1, 단백질 염석

중성 소금은 단백질의 용해도에 상당한 영향을 미친다. 일반적으로 저염 농도에서는 소금 농도가 증가함에 따라 단백질의 용해도가 증가하여 소금 용해라고 한다. 소금 농도가 계속 증가하면 단백질의 용해도가 다른 정도로 낮아지고 연이어 침전된다. 이런 현상을 염석이라고 한다. 단백질 용액에 대량의 소금을 넣으면 고농도의 소금 이온 (예: 황산 암모늄의 SO4 와 NH4) 이 강한 수합력을 가지고 있어 단백질 분자의 수화층을 잡아 탈수시킬 수 있어 단백질 알갱이가 응결되어 침전된다. 염석 때 용액 pH 는 단백질 등전점에서 효과가 더 좋다. 다양한 단백질 분자 입자로 인해,

염석에 영향을 미치는 요인은 (1) 온도: 단백질은 온도에 민감하며 일반적으로 실온에서 작동할 수 있다. 일반적으로 단백질의 용해도는 저온에서는 낮아지지만 헤모글로빈, 미오글로빈, 알부민과 같은 일부 단백질은 고온에서 (25 도) 용해도가 0 도보다 낮다. 염석에 더 취약하다. (2)pH 값: 대부분의 단백질은 등전점에서 농축염 용액 중 용해가 가장 낮다. (3) 단백질 농도: 단백질 농도가 높을 때 분리할 단백질은 종종 다른 단백질 장소와 함께 침전된다 (* * * 침전 현상). 따라서 염석 전에 같은 양의 생리염수로 혈청을 희석하여 단백질 함량이 2.5 ~ 3.0% 에 이를 수 있도록 해야 한다.

단백질 염석에 일반적으로 사용되는 중성염은 주로 황산암모늄, 황산마그네슘, 황산나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨이다.

가장 널리 사용되는 황산 암모늄은 온도 계수가 낮고 용해도가 높다는 장점이 있다 (25 C 에서 포화용액은 4. 1M, 즉 767G/L; 0 ℃에서의 포화 용해도는 3.9M, 즉 676 g/L) 이다. 이 용해도 범위 내에서 많은 단백질과 효소가 소금으로 분석될 수 있다. 또한 황산 암모늄의 단계적 염석 효과는 다른 소금류보다 우수하여 단백질 변성을 유발하기 쉽지 않다. 황산 브롬 용액의 pH 값은 보통 4.5 ~ 5.5 사이이며, 다른 pH 값으로 염석할 때는 황산이나 암모니아수로 조절해야 한다.

단백질은 염석과 침전을 거쳐 분리되면 단백질에서 소금을 제거해야 한다. 일반적인 방법은 단백질 용액을 주머니 (보통 셀로판) 에 넣고 완충액으로 투석하고 완충액을 교체하는 투석이다. 투석은 시간이 오래 걸리기 때문에 저온에서 하는 것이 좋다. 또한 포도당 젤 G-25 또는 G-50 을 기둥을 통해 소금을 제거하는 데도 사용할 수 있어 시간이 오래 걸립니다.

2, 등전점 침전 법

단백질이 정전기 상태에 있을 때 입자 사이의 정전기 반발력이 가장 작기 때문에 용해도가 가장 낮다. 각종 단백질의 등전점이 다르다. 용액의 pH 값을 조절하여 단백질의 등전점에 도달하여 침전할 수 있지만, 이 방법은 단독으로 거의 사용되지 않으며 염석법과 함께 사용할 수 있다.

저온 유기 용매 침전 법

메탄올, 에탄올, 아세톤과 같이 물과 섞인 유기용제를 사용하면 대부분의 단백질의 용해도를 낮추고 침전시킬 수 있다. 이 방법의 해상도는 염석법보다 높지만 단백질은 변성하기 쉬우므로 저온에서 진행해야 한다.

(2) 단백질 분자의 크기에 따라 다른 분리 방법.

1, 투석 및 한외 여과

투석은 반투막을 이용해 다른 분자 크기의 단백질을 분리하는 것이다.

한외 여과법은 고압이나 원심력을 이용하여 물과 기타 용질 소분자가 반투막을 통과하도록 강요하는 반면 단백질은 막에 남아 있다. 서로 다른 구멍 지름의 필터를 선택하여 분자량이 다른 단백질을 차단할 수 있습니다.

2. 겔 여과법

분자 배제 크로마토 그래피 또는 분 자체 크로마토 그래피라고도하며 분자 크기에 따라 단백질 혼합물을 분리하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. 기둥에서 가장 많이 사용되는 충전재는 포도당 젤 (Sephadex) 이다

Ged) 와 아가로 오스 젤.

(3) 단백질의 하전 특성에 따라 분리한다.

단백질은 pH 환경에 따라 전하와 전하가 다르기 때문에 분리할 수 있다.

1, 전기 영동

같은 pH 조건에서는 분자량과 전하가 다르기 때문에 전기장에서 다양한 단백질의 이동률이 다르기 때문에 분리할 수 있습니다. 주목할 만한 것은 양성 전해질을 전달체로 사용하는 등전집중 전기 영동이다. 전기 영동에서는 양성 전해질이 양극에서 음극까지 점차 증가하는 pH 그라데이션을 형성하고, 일정한 전하를 가진 단백질이 헤엄칠 때 등전점에서 pH 위치가 멈춘다. 이 방법은 다양한 단백질을 분석하고 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

이온 교환 크로마토 그래피

이온 교환제에는 양이온 교환제 (예: 카르복시 메틸 섬유소) 가 포함됩니다. CM- 셀룰로오스 및 음이온 교환제 (디 에틸렌 아미노 에틸 셀룰로오스; 딘? 서체

페이스 = "é"

LANG = "ZH-CN">；; 셀룰로오스), 분리 된 단백질 용액이 이온 교환 크로마토 그래피 칼럼을 통과 할 때 이온 교환기 전하와 반대되는 단백질이 이온 교환기에 흡착되어 pH 또는 이온 강도를 변경하여 흡착 된 단백질을 씻어 낸다 (크로마토 그래피 섹션 참조).

(4) 친화층 분석, 리간드 특이성에 기반한 분리 방법.

친화층 분석

크로마토 그래피) 는 단백질을 분리하는 매우 효과적인 방법입니다. 매우 복잡한 단백질 혼합물에서 정제할 단백질을 분리하는 데는 보통 한 단계만 필요하다. 그리고 순도가 매우 높다. 이 방법은 일부 단백질이 * * * 가 아닌 리간드라는 다른 분자 특이성과 결합될 수 있다는 사실에 기반을 두고 있다. 그 기본 원리는 단백질이 복잡한 혼합물 형태로 조직이나 세포에 존재하고, 각 유형의 세포에는 수천 가지의 다른 단백질이 들어 있기 때문에 단백질이 분리되고 순화된다는 것이다.

표상은 생화학의 중요한 구성 요소이다. 지금까지 복잡한 혼합 단백질에서 어떤 종류의 단백질도 추출할 수 있는 단일한 방법이나 기성된 방법이 없었기 때문에 종종 여러 가지 방법으로 함께 사용되었습니다.

세포 분열

1. 고속 조직 빻기: 재료를 묽은 덩어리로 만들어 부피가 약 1/3 인 항아리에 넣고, 실린더 헤드를 덮고, 먼저 거버너를 가장 느린 위치로 옮긴 다음 스위치를 켜서 원하는 속도로 가속한다. 이 방법은 동물의 내장, 식물 육질 씨앗 등에 적용된다.

2. 유리균질기로 균질화: 먼저 잘라낸 조직을 시험관에 넣은 다음 연마봉에 넣고 앞뒤로 연마하여 연마 세포를 위아래로 움직입니다. 이 방법은 고속 조직 으깬 장치보다 세포 분쇄 정도가 높으며 소량의 동물 기관과 조직에 적용된다.

3. 초음파 처리법: 일정한 전력의 초음파로 세포 현액을 처리하여 세포가 심하게 진동하여 파열되게 한다. 이 방법은 미생물 재료에 가장 적합하다. 대장균은 각종 효소를 준비하는데, 종종 50- 100 mg 균 /ml 의 농도를 1KG 에서 10KG 로 선택한다.

4. 반복 해동법: 세포를-20 C 이하로 냉동시키고 실온을 녹여 여러 번 반복한다. 세포 중 얼음알의 형성과 잔여 세포액 중 소금 농도의 증가로 인해, 그것들은 팽창하고 세포 구조를 파괴한다.

5. 화학치료: 일부 동물세포 (예: 종양세포) 는 12 탄기황산나트륨 (SDS), 디옥소담산나트륨 등 세포막에 의해 파괴될 수 있으며 세균 세포벽이 두꺼워 리소자임으로 더 잘 치료할 수 있다.

어떤 방법으로 조직과 세포를 깨뜨리든 세포 내의 단백질이나 핵산 분해효소는 용액에 방출되어 대분자의 생분해를 일으켜 천연물을 감소시킨다. DFP (인산이 이소 프로필 에스테르) 를 첨가하면 자기 용해를 억제하거나 늦출 수 있다. 요오드 아세트산을 첨가하면 활성 센터에서 소수기단이 필요한 단백질 해체효소의 활성화를 억제하고, 벤질 유틸라늄 (PMSF) 을 첨가하면 단백질 가수 분해칩의 활성을 제거할 수 있지만 전부는 아니다. PH, 온도 및 이온 강도를 선택하여 이러한 조건은 대상 물질 추출에 적합해야 합니다.

농축, 건조 및 보존

첫째, 샘플 농도

생물 대분자의 제비 과정에서 샘플은 기둥 순수화로 인해 매우 희게 변하여 보존과 검진을 위해 농축이 필요한 경우가 많다. 일반적인 농축 방법은 다음과 같습니다.

1, 감압, 가열, 증발 및 농축

표면 압력을 줄여 액체의 끓는점을 낮추다. 감압의 진공도가 높을수록 액체의 끓는점이 낮을수록 증발이 빨라진다. 이 방법은 일부 열 불안정 생물 대분자의 농축에 적용된다.

2, 기류 증발 농도

공기의 흐름은 액체의 증발을 가속화하고, 그것을 얇은 용액으로 확산시키고, 표면은 끊임없이 기류를 통과한다. 또는 생체 고분자 용액을 투약봉지에 넣고 냉실에 넣고 선풍기로 바람을 쐬면 침투막 밖의 용제가 증발하지 않아 농축의 목적을 달성할 수 있다. 이런 방법은 농축 속도가 느려서 대량의 용액 농축에 적합하지 않다.

3. 응고법

생물 대분자는 저온에서 얼음을 형성하고, 소금과 생물 대분자는 액상에 머물러 얼음에 들어가지 않는다. 작동 시 농축될 용액을 고체로 식힌 다음 천천히 녹여 용제와 용질 융점의 차이를 이용하여 대부분의 용제를 제거한다. 예를 들어 이런 방식으로 단백질과 효소의 소금 용액을 농축하면 단백질과 효소를 함유하지 않는 순수 얼음 결정이 액체 위에 떠 있는 반면 단백질과 효소는 하층 용액에 농축되어 상층 얼음을 제거함으로써 단백질과 단백질을 얻을 수 있다.

4. 흡수법

용액 속의 용액 분자는 흡수제에 의해 직접 제거되어 농축된다. 사용하는 흡수제는 용액과 화학반응이 없고 생물 대분자를 흡착하지 않아 용액과 쉽게 분리되어야 한다. 일반적으로 사용되는 흡착제는 폴리에탄올, 폴리에틸렌피롤, 사탕수수, 젤입니다. 폴리에틸렌 글리콜 흡수제를 사용할 때는 먼저 바이오 고분자 용액을 반투막봉투에 넣은 다음 4 도에 폴리에탄올을 덮으면 주머니 속의 용제가 폴리에탄올에 빠르게 흡수된다. 폴리에탄올이 물에 포화될 때, 새로운 것을 교체해야 한다.

5. 한외 여과법

한외 여과는 특수한 막을 이용하여 용액 중의 각종 용질 분자를 선별적으로 필터링하는 방법이다. 특정 압력 (질소 압력 또는 진공 펌프 압력) 하에서 액체가 막을 통과하지 않을 때 용제와 소분자가 침투하여 대분자가 차단되고 차단된다. 이것은 최근 몇 년 동안 발전한 새로운 방법으로, 생물대분자, 특히 단백질과 효소의 농축이나 탈염에 가장 적합하며, 비용이 낮고 조작이 편리하며 조건이 온화하다는 장점이 있으며, 생물대분자의 활성을 잘 유지할 수 있다. 회수율이 높다. 한외 여과법 응용의 관건은 막 선택에 있다. 유형과 규격에 따라 막에 따라 물 흐름, 분자량 마감 값 (즉, 일반적으로 막이 보유할 수 있는 분자의 최소 분자량) 과 같은 다양한 매개변수가 있으며, 작업의 필요에 따라 선택해야 합니다. 또한 한외 여과 장치의 형태, 용질의 구성과 성질, 용액 농도 등이 있다. 한외 여과 효과에 일정한 영향을 미친다. 디아블로

한외 여과막의 분자량 마감:

막 이름 분자량 컷오프 큰 평균 조리개

XM-30030000 140

Xm-200100,00055

Xm-5050,00030

PM-30 30 30,00022

Um-2020,00018

PM- 10 10/010,00015

UM-2 1 000 12

UM05500 10

중공 섬유관은 위에서 언급한 한외 여과막으로 만들어졌으며, 이 파이프들 중 많은 것들이 뭉쳐져 있습니다. 파이프의 양쪽 끝에는 낮은 이온 강도의 완충 용액이 연결되어 있어 완충 용액이 튜브 안에서 연속적으로 흐를 수 있다. 그런 다음 섬유관을 투석할 단백질 용액에 담그세요. 완충 용액이 섬유관을 통과할 때, 작은 분자는 막을 통해 쉽게 확산되지만, 큰 분자는 그렇지 않다. 이것이 바로 섬유 필터 분석법으로 투석 면적이 늘어나 투석 시간이 65,438+00 으로 단축되었다.

둘째, 건조합니다

변질과 보존을 막기 위해 생물대분자로 제품을 준비하는 것은 종종 건조처리가 필요하며, 가장 많이 사용되는 방법은 냉동건조와 진공건조이다. 진공 건조는 고온에 견디지 않고 산화하기 쉬운 물질의 건조와 보존에 적합하다. 전체 장치에는 건조기, 냉응기 및 진공 건조 원리가 포함되며 온도 계수가 증가합니다. 같은 압력 하에서 수증기의 압력은 온도가 내려가면서 감소하기 때문에 저온저압에서는 얼음이 기체로 승화되기 쉽다. 작동 중에 건조할 액체를 빙점 아래로 얼려 고체로 만든 다음 저온저압에서 용제를 기체로 변환하여 제거한다. 건조한 제품은 푸석푸석하고 용해성이 좋고 구조가 자연스러워 각종 생물 대분자의 건조와 보존에 적합하다.

셋째, 스토리지

생물학적 거대 분자의 안정성은 보존 방법과 밀접한 관련이 있습니다. 건조 후 제품은 일반적으로 비교적 안정적이며, 저온에서 며칠, 심지어 몇 년 동안 그 활성화는 눈에 띄게 변하지 않는다. 보관 요구 사항은 간단합니다. 건조된 샘플을 건조기 (건조제 가득) 에 밀봉하고 0 ~ 4 도 냉장고에 보관하면 됩니다. 액체로 저장할 때는 다음 사항에 주의해야 한다.

1, 샘플은 너무 묽을 수 없습니다. 반드시 일정한 농도로 농축해야 포장이 보존됩니다. 너무 묽은 샘플은 생물학적 대분자를 변성시키기 쉽다.

2. 일반적으로 방부제와 안정제를 첨가해야 한다. 일반적으로 사용되는 방부제는 톨루엔, 벤조산, 염소 모조, 사향초페놀 등이다. 단백질과 효소는 보통 황산 플루토늄, 사탕수수, 글리세린 등에 의해 안정된다. 예를 들어, 효소는 또한 기질과 보조효소를 첨가하여 안정성을 높일 수 있다. 또한 칼슘, 아연, 붕산 등의 용액도 일부 효소에 일정한 보호 작용을 한다. 핵산 대분자는 보통 염화나트륨이나 레몬산 나트륨의 표준 완충액에 저장된다.

3. 보관 온도가 낮아 대부분 냉장고에 0 도 정도 보관돼 있고, 낮은 것도 있는데, 다른 물질에 따라 다릅니다.