수의학 체외 진단 동향 - 분자 진단

애완동물은 현대인의 중요한 가족 구성원이 되었고, 그들의 음식, 의복, 생활, 노년, 질병 및 죽음을 중심으로 수천억 수준의 '경제' 산업 사슬이 형성되었습니다. 그 중 수요가 많고 소비자 지출이 높은 애완동물 의료는 산업 체인에서 핵심 위치를 차지하고 애완동물 소비에서 '가장 큰 플레이어'가 되었습니다.

애완동물 의료 서비스에는 반려동물을 위한 질병 진단, 치료, 일일 건강 관리 서비스 제공이 포함되며, 반려동물 산업에서 사료에 이어 두 번째로 큰 부문입니다. 반려동물의료서비스는 질병 종류에 따라 반려동물 수술질환, 내과질환, 피부과, 감염병 진단 및 치료, 반려동물 예방접종 등이 있습니다. 감염병은 박테리아, 바이러스 등 특정 병원성 미생물에 의해 발생하는 질병으로, 특정 동물 간 또는 여러 동물 간에 전염될 수 있습니다. 애완동물을 잘 키우는 열쇠는 질병, 특히 일부 전염병은 급성 발병하고 빠르게 확산되어 동물의 건강에 큰 위협이 되는 질병을 예방하고 치료하는 것입니다.

사람들의 삶의 질이 점차 향상되면서 개와 고양이는 사람들의 삶에서 점점 더 중요한 역할을 하고 있습니다. 더욱이 주인의 태도와 반려동물 의료의 질이 해마다 향상되면서 동물 질병 진단의 정확도도 기존의 '코끼리를 느끼는 시각 장애인'에서 분자진단 수준으로 점차 옮겨가고 있다.

현재 분자진단 기술은 감염성 질환(세균 감염, 바이러스 감염, 기생충, 곰팡이, 인간 및 동물 감염 질환 등 포함), 종양 및 기타 여러 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 분자진단 검사 결과가 임상의학 결정에 미치는 기여도는 더욱 높아졌으며, 검사 결과의 중요성은 유례없는 수준에 이르렀습니다.

애완동물 감염병 검출 기술 측면에서 분자진단 핵산 검출 방법 역시 민감도와 특이도가 매우 높아 감염병 검출 기간을 최대한 단축할 수 있다. 이 방법은 인간의 감염성 질환을 임상적으로 진단하는 황금방법이기도 하다.

그 중 PCR은 분자진단에 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. PCR 기술은 한 쌍의 올리고머 DNA를 프라이머로 사용하여 여러 번의 변성-어닐링-신장 과정을 통해 표적 DNA를 증폭시키는 기술로 민감도와 특이도가 높은 장점이 있습니다.

실시간 형광 정량 PCR은 정성적 PCR에서 정량적 PCR로 질적 도약을 이루었습니다. 실시간 형광 정량 PCR 기술(PCR 반응 시스템에 형광 그룹을 추가하고, 형광 신호를 사용하여 전체를 축적하고 모니터링함) PCR in real time(실시간 PCR 프로세스)은 기존 PCR의 장점을 가질 뿐만 아니라 강한 특이성, 고감도, 우수한 반복성, 빠른 반응 속도, 정확한 정량 및 높은 자동화 수준의 특성을 가지며 국제적으로 인정받는 표준이 되었습니다. 핵산 분자의 정량화 방법.

실시간 형광 정량 PCR은 반려동물 질병을 조기에 정확하게 진단할 수 있습니다.

현재 반려동물 임상 연구에서는 일부 병원체를 정확하게 진단하기 어렵거나 불가능하다는 문제가 널리 퍼져 있습니다. 이는 다음과 같은 측면에서 구체적으로 반영됩니다.

1. 기존 진단 기술은 감도가 낮습니다.

예: 콜로이드 금 테스트 스트립은 일반적으로 바이러스 진단에 사용됩니다. 콜로이드 금 테스트 스트립은 신속한 진단을 제공할 수 있지만 이 방법은 단백질 수준에서 병원체를 검출하며 동물 자가항체의 어느 정도 교차 반응 및 간섭이 있어 임상 적용 시 위양성 및 위음성 결과가 발생합니다. >

2. 질병(예: 잠복기) 및 항원 요구량이 높은 질병의 조기 진단

예: 전통적인 진단 기술(콜로이드 금 테스트 스트립 및 ELISA 검출 방법)을 사용하면 제공할 수 없습니다. 에 따른 정확한 진단. 예를 들어 개 홍역, 파보바이러스 등은 임상적으로 흔하다.

3. 상업화되고 편리한 시약이 없는 임상 병원체가 많다

병원체 진단에 있어서 이 부분( 고양이 전염성 복막염 등)은 현재 병원의 수의학 임상 업무에서 진단할 수 없습니다. 혈액 도말이나 대변 검사가 필요한 질병의 경우 매우 주관적이어서 검사를 놓치기 쉽습니다.

4. 전염병 예방 및 통제 과정에서

예를 들어 다음과 같습니다. 개와 고양이의 바이러스성 질병을 예방하기 위한 주요 대책은 백신을 주사하는데, 혈청학에서 검출된 항체가 백신 면역에 의한 것인지, 바이러스 감염에 의한 것인지 구별하기 어려운 반면, PCR은 병원체를 정확하게 검출할 수 있다.

5. 임상적으로는 바베시아 파르붐(Babesia parvum) 및 기타 질병과 같이 미량으로 존재하면 진단하기 어려운 병원체가 있습니다.

따라서 PCR(특히 실시간 형광 정량 PCR)을 이용하면 이러한 질병에 대한 정확한 진단이 현실화됩니다.

농림축산식품부 '2013년 국가 가축질병 감시 및 역학조사 계획'의 요구사항과 우리나라 현행 애완동물 질병 진단 국가표준에 따라 '개 파보바이러스 진단기술'이 (GB/T27533-2011)' 및 '개 홍역 진단 기술(GB/T27532-2011)' 국가 기술 표준에서는 개 파보바이러스 및 개 홍역 바이러스 핵산 검출(시험지 카드 검출이 아닌)을 진단 표준으로 명확하게 사용합니다. 이는 또한 핵산 검출이 동물 질병 진단에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

애완동물 진단에는 적합한 PCR 제품을 선택하는 것이 특히 중요합니다.

현재 임상 작업에서는 핵산 추출이 필요 없는 PCR 제품과 등온 PCR 제품을 포함하여 수의사가 선택할 수 있는 PCR 제품이 많이 있습니다. 증폭, 액체 시약, 동결건조 시약, 전자동 PCR 등은 수의사에게 선택의 여지가 없습니다. 이를 어떻게 객관적으로 보고 과학적 선택을 해야 하는지는 다음에서 자세히 설명하겠습니다.

핵산 추출을 피하면 위음성 가능성이 높아집니다

핵산 추출은 분자진단 실험의 '첫 번째 단계'이며, 애완동물 샘플을 먼저 채취해야 하기 때문에 매우 중요한 단계입니다. 핵산이 추출된 후에만 후속 검출이 수행될 수 있으며 이는 핵산 추출의 중요성을 보여줍니다. 핵산 추출에는 정제(샘플 내 간섭 물질 제거)와 농축(샘플 내 핵산 농도 증가)의 두 가지 주요 목적이 있습니다. PCR로 검사한 검체(혈청, 전혈, 세포보존액, 대변 등)에는 간섭물질 및 억제제가 많고 핵산 함량이 낮아 핵산을 직접 검출하기 어렵고 민감도가 좋지 않습니다. . 따라서 검출에 앞서 시료 내 핵산을 절단, 정제, 농축하는 과정, 즉 핵산 추출 과정을 거쳐야 합니다. 이것이 업계의 주류 접근 방식입니다.

예를 들어, 일부 임상 비인두 면봉 및 구강 면봉의 용출액은 매우 단순한 구성을 가지며 거의 정상적인 식염수 + 소량의 분비물 + 다량의 유리 바이러스를 직접 증폭시킬 수 있습니다. 핵산 추출 없이. 고양이 헤르페스 바이러스 FHV-1은 입과 코에서 채취한 면봉으로 검출할 수 있습니다. 면봉의 용출액이 상대적으로 깨끗한 경우 정제 단계를 생략할 수 있지만 농축되지 않으면 검사 감도가 감소합니다.

또한 복잡한 샘플은 핵산 추출을 거쳐야 합니다. 예를 들어, 고양이 코로나바이러스(FCoV)는 대부분 고양이 복수에서 검출됩니다. 복수 샘플은 점성이 매우 높고 단백질이 많이 포함되어 있어 직접 확장 및 검출이 불가능합니다. 이렇게 추출하지 않고 시료를 직접 증폭시키는 방식은 감도가 떨어지는 문제가 아니라, 이를 감지할 수 없다는 문제가 있습니다.

등온 증폭은 가격이 비싸고 특허 보호 제품이 많다는 단점이 있습니다.

등온 증폭 기기는 간단하고 감지 시간이 빠르며 감지 감도가 비슷합니다. PCR. 그러나 등온 증폭 기술은 대부분 외국에서 발명되었으며 아직 특허 보호 기간 내에 있으며, 그 응용은 아직 대중적이지 않으며 비용도 상대적으로 높습니다.

진공 동결건조 기술은 많은 장점을 가지고 있으며 PCR 시약의 추세입니다.

PCR의 시약 구성 요소에는 정제수, 프라이머, 폴리머라제, Mg2+, dNTP 및 프로브가 포함됩니다. 이들 성분을 혼합한 후에는 상온에서 점차 분해되어 효능을 잃게 됩니다. 따라서 액체 PCR 시약은 여러 개의 바이알에 나누어 -20°C에서 보관한 후 필요할 때 해동하여 준비해야 합니다. 따라서 시약의 보관, 운송 및 작동이 번거롭습니다.

진공 동결건조 기술은 유효성분을 파괴하지 않고 시약 내부의 수분을 완벽하게 승화시킬 수 있다. 동결건조된 시약은 저온 유통 운송 없이 실온에서 보관할 수 있습니다. 사용시 물을 첨가하여 녹인 후 일반 PCR 시약처럼 사용할 수 있어 PCR 시약의 추세입니다.

여기서는 효소 등온 증폭 기술(ERA 기술)에 대해 완전히 독립적이고 독립적인 지적재산권을 보유하고 있는 새로운 형태의 핵산 증폭 기술인 Suzhou Gendx Gene(gendx.cn)을 소개하고자 합니다. ), 유전공학을 통해 recombinase, exonuclease, Polymerase 등의 다중효소 시스템을 변형하여 30~42°C의 항온 조건에서 20분 이내에 미량의 DNA/RNA의 특정 세그먼트를 증폭시키는 특수 증폭 반응 시스템을 구축합니다. 몇 분 내에 10^9배 증폭하여 감지 가능한 수준에 도달할 수 있습니다. 이 기술은 PCR 증폭의 특이성과 등온 증폭 LAMP 기술의 편리성을 동시에 갖고 있으며 정확도가 매우 높습니다.

검출성, 민감성, 신속성, 특이성 등의 장점을 가지고 있으며, 반응성분을 혼합, 동결건조하여 건조분말상태로 하여 조작이 용이하고 보관이 용이합니다. 그리고 전 과정을 자체 생산하기 때문에 상대적 가격도 더 유리합니다. 동시에 형광 항온 증폭 장비와 결합하면 더 이상 위치, 시간 또는 인력에 제한을 받지 않고 현장에서 핵산을 검출할 수 있습니다.

체외진단 기술의 4차 혁명인 분자진단은 분자생물학적인 방법을 응용하여 환자(반려동물)의 유전물질의 구조나 발현 정도의 변화를 검출하여 진단하는 것입니다. 질병의 진단, 예측, 진단, 치료, 결과를 보다 정확한 정보를 제공하는 기술입니다. 다른 탐지 방법에 비해 비교할 수 없는 장점이 있습니다. PCR은 분자진단에 가장 일반적으로 사용되는 검출방법으로 반려동물의 임상진단에 있어서 점점 그 중요성이 커질 것입니다. 동시에, 우리 Xianda Gene의 등온 증폭 핵산 검출 기술은 신속한 검출과 저렴한 가격의 장점으로 적시 현장 검출 시장에서 두각을 나타낼 것이라고 믿습니다.