유전자 복제

재조합 DNA 기술이라고도 알려진 유전자 클로닝 또는 분자 클로닝은 효소 절단, 결찰 및 기타 작업을 통해 시험관 내에서 다양한 소스의 DNA 분자를 하이브리드로 재조립하는 효소적 방법을 적용하는 과정입니다. 적절한 숙주 세포에 분자가 결합하여 많은 수의 자손 DNA 분자를 형성합니다. 예를 들어, 인간 게놈에서 특정 유전자를 얻으려면 유전자 클로닝 기술을 사용하여 표적 유전자를 분리, 복제 및 증폭해야 합니다. 따라서 다음에는 유전자 클로닝 도구와 구체적인 실험 과정을 소개하겠습니다.

(1) 제한 엔도뉴클레아제

첫 번째 도입은 박테리아의 "제한-수정 시스템" 방어 메커니즘의 중요한 구성원인 제한 엔도뉴클레아제입니다. Restriction-Modification System(R-M 시스템), 즉 제한 효소와 메틸라제 시스템(그림 1)[1]. 연구자들은 외부 DNA 분자의 특정 부분을 인식하고 절단하고, 외부 DNA를 비활성화하고, 외부 파지의 재생산을 제한할 수 있는 효소를 제한 엔도뉴클레아제(RE, 제한 효소 또는 제한 효소라고 함)라고 부릅니다. 숙주 박테리아의 DNA가 메틸라제에 의해 메틸화되면 DNA의 효소 절단 부위가 보호되어 제한 효소에 의해 절단되지 않습니다.

제한 엔도뉴클레아제의 구조, 인식 부위, 절단 부위 및 기타 특성에 따라 RE는 4가지 범주로 나눌 수 있습니다(표 1)[2]. Type II 제한 효소는 유전자 클로닝에 일반적으로 사용됩니다. .다이서 효소. 그러나 변형된 DNA를 인식할 수 있는 IV형 엔도뉴클레아제는 후생유전학 연구에 사용될 수 있습니다.

Type II 제한 엔도뉴클레아제는 가장 흔히 발견되는 엔도뉴클레아제 유형으로 인식 부위와 절단 부위의 특성에 따라 여러 하위 유형으로 나눌 수 있습니다[3]. 회문 서열인 Eco R I은 Type IIP에 속하며, 현재 CRISPR/Cas9 관련 유전자 클로닝에 사용되는 Bpi I과 같은 효소의 절단 부위는 Type IIS에 속합니다. 인식 장소에서 몇 개에서 수십 개의 기지가 떨어져 있습니다.

제한 엔도뉴클레아제이기 때문에 DNA를 절단한 후에는 끈끈한 말단과 둔한 말단 등 다양한 말단 유형이 남게 됩니다(그림 3). 소위 끈적이는 말단은 효소 소화 후 5'말단이나 3'말단에 염기가 돌출되어 있는 말단형이므로 Hind III와 같은 5' Overhang end와 3' Overhang으로 나누어진다. Pst I과 같은 끝. 소화 후 돌출 염기가 없는 것은 Eco R V와 같이 둔기형입니다.

DNA 염기는 5', 3' 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있습니다. 제한효소가 DNA를 절단하면 5'-P와 3'-OH가 나타납니다(그림 4).

또한 제한효소의 기능에 따라 이소절단효소, 이소절단효소, 호모절단효소, 가변효소, 변형감응성 엔도뉴클레아제 등의 종류가 있다(그림 5). 그중 이종 동위효소(heterologous isozymes)라고도 알려진 이소스키조머(isoschizomers)는 서로 다른 원핵생물에서 분리된 서로 다른 유형 II 효소로 Age I 및 Bsh T I과 같은 인식 특성과 절단 부위가 동일합니다. Isoschizase 효소는 동일한 뉴클레오티드 서열을 인식하지만 Sma I 및 Xma I과 같은 다른 위치에서 DNA를 절단합니다. Isocaudarmer는 인식 및 절단 서열이 특정 상관 관계를 갖고 있으며 Age I 및 Xma I과 같이 작용 후 동일한 끈적끈적한 말단을 생성할 수 있는 다양한 소스의 효소를 말합니다. 이러한 유형의 효소에 의해 소화된 생성물은 연결이 중요한 역할을 합니다. 유전자 복제 중. 가변 효소는 인식하는 DNA 서열 중 하나 또는 여러 개의 염기가 가변적이며 인식 서열이 종종 6개 염기쌍을 초과하는 것을 의미합니다. 예를 들어 Bst E II 인식 서열은 GGTNACC이며, 여기서 N은 가변 염기입니다. A/T/C/G 네 가지 유형 중 하나일 수 있으며 Bst NI의 인식 순서는 CCWGG입니다. 여기서 W는 A 또는 T를 나타냅니다. 변형 민감성 엔도뉴클레아제는 DNA 변형(예: 메틸화 변형)에 민감한 제한 엔도뉴클레아제입니다. 예를 들어, Bcl I은 메틸화된 인식 부위를 절단할 수 없지만 Dpn I은 정반대인 경우에만 절단될 수 있습니다. 그것은 메틸화되어 있습니다.

제한효소의 종류가 너무 많은데 어떤 것을 선택해야 할까요?

먼저, 서열 분석을 위해 온라인(Sequence Manipulation Suite 및 analyze-sequence, Addgene) 또는 로컬 버전(SnapGene) 분석 도구를 사용할 수 있는 제한 사이트 분석을 수행해야 합니다. 그런 다음 iso-, iso-, iso- 및 가변 효소의 특성을 기반으로 RE를 선택하고 변형에 대한 선택된 제한 효소의 민감도도 고려해야 합니다. 또한, 시약에 사용되는 효소의 수에 따라 효소소화반응을 단일효소소화, 이중효소소화, 단계별 효소소화로 나누어 진행하고 있습니다.

단일 효소 분해: 동일한 시스템이 하나의 효소 분해 반응을 수행합니다. 이중 효소 분해: 동일한 시스템이 두 개의 효소 분해 반응을 수행합니다(동일한 반응 조건의 제한 효소). 단계적 효소 분해: 첫 번째 효소 분해 반응 후 시료가 완전히 처리됩니다. , 정제한 후 2차 효소 소화 반응을 수행합니다(반응 조건이 다른 제한 효소의 경우). 위의 정보를 명확히 한 후 효소 소화 반응을 진행할 수 있습니다. 효소 소화 반응에는 시료 유형, 완충액, 효소 양, 반응 온도 및 반응 시간 등이 포함됩니다. 이는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제품 지침을 참조하여 수행할 수 있습니다.

(2) DNA 리가아제

제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하는 역할을 하며, DNA 리가아제는 DNA를 다시 연결하는 데 사용되는 도구입니다. DNA 리가아제는 이중 가닥 DNA에서 인접한 염기의 5' 인산염과 3' 수산기 사이의 포스포디에스테르 결합 형성을 촉매하는 효소의 일종입니다(그림 6). 이중 가닥이기 때문에 일반적으로 연결 부위에 염기 불일치가 없어야 합니다. 그러나 실제 적용에서 DNA 리가아제는 소수의 불일치로 DNA를 결찰할 수도 있습니다. DNA 리가아제에는 두 가지 주요 유형이 있습니다. T4 DNA 리가아제(무딘 끝과 끈적한 끝을 모두 연결할 수 있음)와 E. coli DNA 리가아제(끈끈한 끝만 연결할 수 있음)입니다.

(3) DNA 중합효소

앞서 우리는 DNA 중합효소를 사용하는 PCR 중합효소 연쇄반응을 소개했습니다. 실제로 DNA 중합효소에는 세 가지 효소 활성이 있습니다(그림 7): 새로운 가닥 DNA 합성을 위한 DNA 중합효소 활성, 오류가 포함된 염기 교정을 위한 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성, RNA를 제거하는 데 사용되는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 DNA 복제 중 프라이머. 이 활동을 통해 Nick 번역을 수행할 수 있으며 이는 뉴클레오티드 삽입 등을 표시하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 모든 DNA 중합효소가 이 세 가지 효소 활성을 갖는 것은 아닙니다. NEB 공식 웹사이트에서는 일련의 DNA 중합효소와 그 기능적 활성을 제공합니다(DNA 중합효소 선택 차트-NEB).

PCR 산물의 말단에는 사용된 DNA 중합효소의 종류에 따라 3'-A 끈적한 말단과 둔한 말단이 있습니다. 그중 Taq DNA 중합효소는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족하여 PCR 충실도가 낮고 PCR 산물의 3' 말단에는 끈적끈적한 말단 A가 더 많이 있는 반면 고충실도 DNA 중합효소는 3'-5'를 유지합니다. exonuclease 활성을 가지며 매우 높은 교정 활성을 가지며 PCR 산물은 blunt end를 가지고 있습니다.

(4) 원활한 클로닝 기술

위에 소개된 중국의 전통적인 유전자 클로닝에 사용되는 관련 도구 외에도 연구자들은 삽입 단편 및 선형화된 벡터를 기반으로 하는 새로운 도구를 개발했습니다. 최종적으로 상동재조합을 수행하는 복제기술, 즉 Seamless Cloning에는 주로 Gibson Assembly[4]와 Getway Clone이 있다. 여기서는 Gibson Assembly에 중점을 둡니다.

Gibson Assembly 기술에는 DNA 5' Exonuclease, DNA Polymerase 및 DNA Ligase 활동이 포함됩니다. 소스 재조합 방법은 하나 이상의 DNA 단편을 미리 정해진 방향으로 빠르고 효율적이며 정확하게 삽입할 수 있으며, 최종적으로 구축된 클론에는 추가적인 염기서열이 없기 때문에 '심리스 클로닝(seamless cloning)'이라고 부른다. 그림 9의 Gibson Assembly에서 볼 수 있듯이 빨간색과 녹색 조각은 연결되어야 하는 이중 가닥 DNA 조각입니다. 먼저 50°C, T5에서 동일한 15-25개의 중첩 서열(검은색)이 있습니다. 엑소뉴클레아제 핵산은 제거됩니다. Dicer는 5' 말단에서 일부 염기를 분해하여 3' 말단에 돌출된 단일 가닥을 형성하고, 3' 말단 단일 가닥은 상보적이고 어닐링된 후 Phusion 고충실도 폴리머라아제가 그 사이의 간격을 채웁니다. 두 개의 단일 가닥, 마지막으로 Taq DNA 리가제 인접한 단일 가닥 닉이 연결되어 완전한 DNA 이중 가닥 DNA를 형성합니다(그림 6).

연구진은 Gibson Assembly를 기반으로 T5 엑소뉴클레아제 엑소뉴클레아제만 첨가하여 재조합 클로닝도 달성할 수 있는 TEDA[5]를 개발했습니다. 이는 결함이 있는 DNA를 복구하기 위해 세포 내 DNA 복구 메커니즘을 사용합니다. .

(5) 도구 벡터

다음으로 유전자 복제에 흔히 사용되는 도구 벡터를 소개합니다. 벡터는 기능에 따라 클로닝 벡터와 발현 벡터로 구분된다(표 2). 클로닝 벡터는 원핵세포에서 복제가 가능한 요소를 포함하고 있으며, 유전자의 클로닝 및 증폭에 사용되며, 발현 벡터는 클로닝 벡터의 기본 요소뿐만 아니라 전사/번역에 필요한 DNA cis 요소도 포함하고 있습니다. 아래에서는 SnapGene이나 addgene으로 분석한 벡터 구조도를 이용하여 관련 기능 요소를 설명하겠습니다.

클로닝 벡터의 기능 요소를 설명하기 위해 pUC19를 예로 들어 보겠습니다(그림 10).

복제 원점(ORI): ORI는 플라스미드 복제의 시작 위치인 DNA 서열입니다. DNA 헬리카제가 이 서열에 작용하면 DNA의 이중 가닥이 분리되고 복제가 시작됩니다. 플라스미드는 복제 가능해야 합니다. 그렇지 않으면 플라스미드의 양이 박테리아가 성장함에 따라 급속히 희석됩니다. 스크리닝 마커는 주로 항생제 내성 유전자를 가리킨다. 항생제가 포함된 배지에서 박테리아를 배양할 때, 플라스미드가 없는 박테리아는 "죽었기" 때문에 성장할 수 있는 박테리아에는 Amp와 Kan이 포함됩니다. Lac Z: β-갈락토시다제 유전자이자 스크리닝 마커이기도 하며 청색 및 백색 반점 스크리닝에 사용됩니다. 다중 클로닝 부위(MCS)는 외부 유전자의 삽입을 촉진하기 위해 여러 제한 효소에 대한 단일 부위를 포함하는 짧은 DNA 단편입니다. 일반적으로 외인성 DNA 단편이 길수록 삽입하기가 더 어렵고 불안정하며 형질전환 효율이 낮아집니다.

발현 벡터의 기능적 요소를 설명하기 위해 pcDNA3.1을 예로 들어 보겠습니다(그림 11).

? 복제 기원 부위 Ori 및 원핵생물 선택 마커 Amp와 같은 클로닝 벡터 관련 요소 외에도 발현 벡터 pcDNA3.1에는 표 3에 표시된 대로 몇 가지 다른 기능적 요소도 있습니다. .

발현 벡터는 주로 단백질이나 RNA를 발현하는 데 사용됩니다. 예를 들어 유전자 편집에 흔히 사용되는 발현 벡터인 PX458(그림 12)은 Cas9 단백질과 sgRNA를 동시에 발현할 수 있습니다. 따라서 다른 기능적 구성 요소도 포함됩니다(표 4).

위에 소개된 pcDNA3.1과 PX458은 일시적인 발현 벡터로 인간 세포에서 복제가 불가능하며, 세포가 분열하면서 단일 세포 내의 플라스미드가 지속적으로 희석되기 때문에 이들 벡터만으로도 효과를 얻을 수 있다. 즉각적 표현. 렌티바이러스 발현 벡터는 발현 요소가 인간 세포의 게놈에 통합되는 것을 매개할 수 있습니다. 이러한 발현 요소는 게놈 DNA의 복제와 함께 복제될 수 있으므로 안정적인 발현이 달성될 수 있습니다.

당사에서 흔히 사용하는 렌티바이러스 벡터는 HIV-1(Human Immunodeficiency Virus Type I)을 기반으로 개발된 유전자치료 벡터로, 외래 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터가 렌티바이러스 패키징 플라스미드에 함유되어 있으며, 세포주의 도움을 받아 바이러스는 감염성 바이러스 입자로 포장되어 수집 및 농축되어 숙주 세포 또는 동물 모델에 직접 감염될 수 있으며, 외래 유전자는 숙주의 염색체에 효과적으로 통합되어 외인성 유전자의 지속적인 발현이라는 목표를 달성할 수 있습니다. 렌티바이러스 발현 벡터의 일부 주요 기능 요소를 설명하기 위해 pGreenPuro를 예로 들어 보겠습니다(그림 13, 표 5).

(6) 수용 세포

수용 세포는 물리적, 화학적 방법으로 유도된 세포로 주변 환경의 DNA 분자를 흡수할 수 있습니다. 실험실에서는 주로 클로닝용 컴피턴트 세포와 발현용 컴피턴트 세포를 포함하여 컴피턴트 세포를 준비하기 위해 대장균을 사용하는 경우가 많습니다(그림 14).

플라스미드 증폭만 할 경우 일반적으로 클로닝 능력이 있는 세포를 사용합니다. 원핵생물의 단백질을 발현하고 싶다면 발현 능력이 있는 세포를 선택합니다. 또한 다양한 유전자의 결실을 통해 형성되는 다양한 유형의 수용성 세포 유전형이 있으며, 이에 따라 세포에 다양한 요구 사항을 충족할 수 있는 다양한 특성을 부여합니다. 예를 들어, 클로닝 벡터 및 일시적 발현 벡터의 증폭을 위해 E. coli DH5α, TOP10 균주가 종종 사용되는 반면, 렌티바이러스 벡터의 경우 재조합 속도가 낮은 E. coli Stbl3 균주가 일반적으로 선택됩니다. 메틸화되지 않은 벡터의 증폭을 위해서는 E. coli dam-/dcm-?와 같이 메틸화가 부족한 균주를 선택해야 합니다.

2.? 유전자 클로닝 과정

앞서 유전자 클로닝에 사용되는 관련 도구인 효소와 벡터에 대해 알아보았습니다. 다음으로 유전자 클로닝의 실험 과정을 소개합니다. 세분화하면 다음과 같은 10단계로 구성됩니다(표 6).

아래에서는 T/A 클로닝, 전통적인 효소 소화 효소 연결 클로닝 및 심리스 클로닝을 각각 사용하여 lncRNA PVT1의 클로닝 및 발현을 예로 들어 보겠습니다.

(1)?T/A 클로닝

T/A 클로닝은 PCR 단편을 3'-T 오버행이 있는 벡터 DNA와 연결하는 방법입니다(그림 15). 이 방법을 유전자 클로닝에 사용할 경우 제한 부위 문제를 고려할 필요는 없으나 PCR 증폭을 위해 Taq DNA Polymerase를 선택해야 산물의 3' 말단에 추가로 A가 돌출됩니다. T/A 클로닝은 상업용을 사용합니다. T 벡터는 3' 말단에 T가 돌출된 선형화된 벡터로, 유전자 단편이 T 벡터에 연결될 때 방향성이 없으며 정방향 및 역방향 모두 가능합니다.

먼저 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MG562504.1)에서 PVT1(human)의 유전자 서열 정보를 얻은 후 SnapGene 등을 활용하여 PCR 프라이머 디자인을 수행합니다(그림 16). 전장 PVT1 서열(1081nt)을 주형으로 사용하여 설계된 프라이머의 정방향 프라이머의 5' 말단은 PVT1 서열의 5' 말단과 동일하고 역방향 프라이머의 5' 말단은 상보적이다 PVT1 서열의 3' 말단에. 그런 다음 Taq DNA 중합효소를 사용하여 세포의 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하고, 생성물을 아가로스 겔 전기영동 또는 겔 절단을 거쳐 표적 크기 단편을 회수합니다(그림 17).

겔로부터 회수된 유전자 단편을 시판 T 벡터(pMD-18T)와 연결하여 재조합 DNA 벡터 pMD18-PVT1(도 18)을 형성하고 이를 형질전환(도 19)하고 콜로니 PCR을 수행하였다. (그림 20) 후보 양성 클론을 스크리닝한 후 Sanger 시퀀싱(그림 21)을 사용하여 삽입된 서열을 확인하고 양성 클론을 얻었습니다.

(2) 전통적인 제한 효소 소화 효소 연결 클로닝

전통적인 제한 효소 소화 효소 연결 클로닝은 주로 동일한 제한 엔도뉴클레아제(또는 동종효소)를 사용하여 별도로 소화하는 벡터 그런 다음 유전자 단편을 DNA 리가제를 사용하여 결찰하고 형질전환시킵니다. 아래에서는 PVT1을 예로 들어 전통적인 방법을 사용하여 이를 pcDNA3.1 발현 벡터에 복제합니다.

PVT1 유전자의 전체 길이 서열을 얻은 후에는 먼저 제한 엔도뉴클레아제 사이트 분석을 수행해야 합니다. 예를 들어 SnapGene을 사용하여 일반적으로 사용되는 6 염기 인식 사이트의 제한 엔도뉴클레아제 사이트 분석을 수행합니다( 그림 22). 동시에, 우리는 pcDNA3.1의 MCS에서 사용 가능한 제한 엔도뉴클레아제 사이트를 분석합니다. PVT1의 제한 엔도뉴클레아제를 제외하고 사용 가능한 제한 엔도뉴클레아제를 얻기 위해 상동효소(벡터의 자가 결찰을 피하기 위해)를 제외합니다. 여기서는 Nhe I과 Eco R I을 선택합니다(그림 23).

다음으로 PVT1의 전장 서열을 주형으로 사용하여 클로닝 프라이머(SnapGene에서 설계한 프라이머 서열은 T/A 클로닝의 프라이머 서열과 동일)를 설계하는데 추가해야 할 사항도 있습니다. 프라이머의 5' 말단에서의 선택. 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 상응하는 보호 염기(그림 24). Taq DNA 폴리머라제 또는 기타 고성능 DNA 폴리머라제는 세포 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하는 데에도 사용됩니다. 생성물은 아가로스 겔 전기영동 또는 겔 절단을 거쳐 표적 크기의 단편을 회수합니다.

회수된 PVT1 PCR 산물과 pcDNA3.1 벡터를 Nhe I과 Eco R I을 이용하여 이중 분해하였다. 분해 후 PVT1의 서열은 약 1000 bp의 단편과 약 5 bp의 단편이다. Gel Cutting 및 Recovery를 할 필요가 없으며 PCR 산물 정제 컬럼을 이용하여 직접 효소 분해 산물을 정제할 수 있습니다(그림 25). 그러나 pcDNA3.1의 효소 소화에는 불완전하게 절단된 플라스미드(이후 형질전환 중에 많은 수의 위양성 클론이 형성됨)가 존재할 가능성이 있기 때문에 겔 회수를 위해 선형화된 벡터 단편을 절단하려면 아가로스 겔 전기영동이 필요합니다. 그림 25). 그런 다음, PVT1 및 pcDNA3.1 분해된 단편을 DNA 리가제를 사용하여 연결하고 형질전환시켰습니다. 유사하게, 콜로니 PCR 및 Sanger 서열분석을 사용하여 양성 클론 pcDNA3.1-PVT1을 스크리닝했습니다(도 26).

(3) 심리스 클로닝

심리스 클로닝의 중요한 장점은 클로닝할 단편의 효소 절단 부위를 고려할 필요가 없으므로 해당 효소 절단 부위가 벡터를 선형화한 후 벡터의 선형화된 말단을 기준으로 상동성 프라이머를 설계하고 표적 유전자를 PCR 증폭 및 정제하여 직접 재조합, 결찰, 형질전환을 수행합니다(그림 27). 아래에서는 설명을 위해 PVT1을 pcDNA3.1 벡터로 클로닝하는 방법도 설명합니다.

PVT1 및 pcDNA3.1의 전체 길이 서열을 얻은 후 SnapGene, CE Design(Vazyme) 및 In-Fusion Clone(Takara)과 같은 온라인 또는 로컬 소프트웨어를 사용하여 상동성 암 프라이머를 디자인할 수 있습니다. .

상동성 arm 프라이머, 세포 cDNA를 주형으로, high-fidelity DNA 중합효소를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하고 해당 단편을 겔 복구합니다. Nhe I 및 EcoR I을 사용하여 pcDNA3.1 벡터를 이중 분해한 후 젤을 절단하여 벡터 단편을 회수했습니다. 그런 다음 재조합 및 연결을 위한 심리스 클로닝 시약을 추가하고 변환 후 양성 클론을 선별하고 식별합니다.

실제로 심리스 클로닝에는 또 다른 중요한 이점이 있습니다. 즉, 여러 단편의 재조합 클로닝을 동시에 수행할 수 있다는 것인데, 이는 기존 효소 분해-효소 연결 클로닝의 큰 과제입니다. 전통적인 클로닝 기술에 따르면 단편을 클로닝한 후 특정 위치에서 효소 절단 부위를 선택하고 두 번째 단편을 삽입한 후 순서대로 진행해야 할 수도 있습니다. 각 단편 사이의 효소 절단 부위의 염기 서열은 유전자의 완전성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 융합 PCR을 사용하면 복제된 각 단편을 융합하기 위해 말단이 겹치는 프라이머를 디자인할 수 있습니다. 그러나 긴 유전자 단편의 PCR 증폭 역시 실패율이 증가하는 문제가 있습니다(표 8).

요약

이 섹션에서는 유전자 클로닝에 사용되는 도구인 효소와 벡터를 주로 소개하고, T/ A 각각 클로닝, 전통적인 효소 분해-효소 연결 클로닝 및 심리스 클로닝 기술을 위한 실험 절차입니다.

참고문헌

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