면역학 기술 지식 개요 2 장

항체 기본 개념: 다복제 항체 (여러 림프세포 복제에서 분비되는 항체) 와 단일 복제 항체 (단일 B 림프세포 복제에서 분비되는 항체).

단일 클론 항체 기능:

고도의 균일성 (같은 아류), 화학성분이 균일하고 Ig 나 Ig 가 거의 없다.

특이성이 강하여, 특정 표위에만 해당한다.

친화력이 강하다

항원 사용량이 적어 순화할 필요가 없다.

배치 간에 차이가 없습니다

출처가 안정적이고 대량 생산되어 표준화가 쉽다.

침전선을 형성하기 쉽지 않다.

조작이 번거롭다.

어떤 조건에서 단일 클론 항체 제조가 필요합니까?

표적 단백질은 비슷한 구조를 가지고 있다.

항원이 불순하여 분리할 수 없다.

다중 클론 항체 효과가 좋지 않습니다 (비특이적 반응이 제외되었습니다)

항체 치료를 위해 약물로 개발할 수 있기를 바랍니다.

항체 진단을 위해 진단 시약 개발에 사용할 수 있기를 바랍니다.

첫 번째 섹션은 다중 복제 항체 간의 차이점입니다.

첫째, 멀티 클론 항체 준비 원리

항체 준비, 동물 면역 및 항체 정제.

둘째, 다중 저항의 기본 조건

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과립 항원: 세포, 바이러스, 박테리아 등. 일반적으로 면역원성이 강하지만 조제제를 넣지 않고 복강에 직접 주입한다.

수용성 항원: 수용성 항원의 근원은 주로 천연순화이거나 목적 유전자가 원핵 세포나 진핵 세포에서 표현된다. 용해성 항원은 면역을 하기 전에 프씨 조제제와 완전히 섞이거나 완전히 섞이지 않으면 안 된다.

(1) 전체 항원 추출: 세포 분열, 항원 추출, 항원 순화.

(2) 반항원과 전달체의 가교 결합: 전달체의 선택, 반항원과 전달체가 결합되는 방법, 결합복합물의 감정.

(3) 펩타이드 항원의 합성: 면역 원성 펩티드의 선택, 펩타이드의 합성 및 정제.

2. 면역 동물의 선택:

보조제의 제조:

보조제의 종류: 무기보조제, 유기보조제, 합성보조제, 기름제.

셋째, 다 클론 항체 준비의 기본 방법

1 ..? 항원 측정, 면역 경로 및 면역 절차

동물을 면역시키는 방법:

면역의 원래 가치는 다음과 같습니다.

보조제 면역 없음: 입자 항원에 적합

엡실론 보조제 면역 측정법: 가용성 항원에 적합

알루미늄 보조제 면역: 인간 면역에 적합

면역 동물 (일반적으로 여성 동물, 온순한 에너지 생산 선택)

피내면역

피하 또는 근육 면역

림프절면역

혼합법

항체 역도가 만족스러우면 정맥 주사가 면역을 강화한다.

일반적인 사출 방법 피하 주사, 피내 주사, 꼬리 정맥 주사, 정맥 주사

2. 혈액 검사 및 혈액 수집

항혈청의 획득: 안와, 경동맥, 심장채혈.

면역 효과 평가: 혈액 채취 (토끼 귀 동맥, 쥐 꼬리 정맥) 및 검사 (양방향 면역 확산법, ELISA)

항체 분리 및 정제 기술

염석법, 젤여과법, 이온교환색보법, 친화색보법, 전기영분리법.

친화층 분석 원리: 단백질 (항원-항체, 수용체-리간드) 간의 특이성 결합을 이용하여 한 리간드와 겔 입자를 결합시켜 그와 일치하는 물질을 포착하고 다른 물질을 씻어내고 일반적으로 pH 값을 바꾼다.

주요 단계는 단백질을 활성화 기둥과 결합하여 복수 또는 혈청을 처리하고, 기둥을 통과하고, 결합 완충액 (알려진 A280 0 0) 으로 기둥을 씻고, 영안 아미노산 완충액으로 항체 세척을 하고, 같은 양의 세제액을 수집하고, 세제액의 A280 값을 측정하고, A280 값이 현저히 높아진 샘플을 유지하는 것이다.

4. 항체 식별

단백질 농도 측정: 자외선 분광 광도법, 쌍축법, 플린페놀법,

면역 효과 평가: 양방향 면역 확산 및 ELISA.

순도 분석: 단백질 각인 (WB)

항체 카테고리 분석: 면역 골드 테스트 스트립

친화력 분석: ELISA, 형광 편광

5.? 항체 보존

항체 농도: 흡수, 증발 및 한외 여과.

항체 보존: 집중 항의+글리세롤+방부제

면역효과가 좋지 않은 이유는 항원순도가 부족하고 면역원성이 낮으며 면역경로 유화가 불합격하고 면역복용량이 부적절하거나 동물질환이나 종속 차이가 작기 때문일 수 있다.

두 번째 부분? 단일 클론 항체 제조 기술

첫째, 단일 클론 항체 준비 원리

1 B 세포는 1 항체 만 생성할 수 있습니다. 방법: 세포 공학 교배와 b 세포 교배종 기술을 사용 하였다.

단일 복제 B 세포를 종양 세포와 결합해야, 영원히 단일 복제 항체 을 생산할 수 있다.

Barski 등은 세포이마부의 자연 융합 현상을 발견했지만 주파수는 매우 낮았다.

오카다 등은 센다이 천부와 폴리에탄올이 세포 융합의 효율을 현저히 높일 수 있다는 것을 발견했다.

둘째, 단일 클론 항체 준비의 기본 조건

정상 B 세포와 B 세포와 융합된 종양 세포를 배양해야 한다.

1. 동물 면역 항원과 벡터, 동물 선택, 면역 경로

예: 마우스 면역

1 차 면역: 수용성 항원 가프씨 완전 보조제-마우스 등 피하 주사 (4 주 후)

2 차 면역: 수용성 항원 가프씨 불완전 보조제-마우스 등 피하 주사 (3 주 후)

세 번째 면역: 수용성 항원과 생리염수-마우스 복강 주사 (10 일 후 혈청 역가 검출)

면역력 강화: 용해성 항원에 생리염수-마우스 복강 주사 (3 일 후)

세포 융합

2.? 효소 결함 골수종 세포의 배양

세포 DNA 합성 경로:

2 차 황린 (H) 은 퓨린을 통해 HGPRT (2 차 황푸린 새푸린 인산 리보 이동효소) 를 합성해 새푸린 뉴클레오티드를 합성한다.

가슴 (T) 은 피리 미딘 합성 바이 패스 합성 TK (thymidine kinase) 를 통해 thymidine deoxynucleotide 를 더욱 합성합니다.

아미노산, 글루타민, 구아닌단인산은 핵산 생합성을 통한 주요 경로로, 위에서 언급한 두 단계의 합성된 구아닌 뉴클레오티드와 흉선 디옥시오티드 뉴클레오티드와 결합하여 DNA 를 형성한다.

세 번째 단계의 아미노 끝이 아미노 나비트 (A) 로 바뀌면 DNA 를 형성할 수 없다.

따라서 효소 결함 세포의 스크리닝은 HAT 스크리닝이다.

단일 클론 항체 검출 방법의 확립

면역효소 기술

면역 형광 기술

면역 확산 기술

셋째, 단일 클론 항체 준비의 기본 방법

1. 효소 결함 골수종 세포 배양

조직 배양의 기본 조건:

기기: CO2 배양함, 거꾸로 현미경, 초순대, 액체 질소 탱크, 저속 저온 원심분리기가 포함됩니다.

시약: 배양기, HAT 선택성 배양기, HT 배양기, 혈청, 항생제.

소모품: 페트리 접시, 배양물, 빨대, 빨대.

골수종 세포주의 핵심 사항 선택:

(1)? 선택한 골수종 세포는 면역 비장 세포를 제공하는 동물계와 같아야 한다.

(2)? 스스로 면역 글로불린의 중사슬과 경사슬을 생산하지 않는다.

(3)? 아미노 피리딘에 민감하다

(4)? 면역비장 세포와 융합한 후 안정적인 분비형 Ig 교잡세포를 생산한다.

수유 세포의 제조

세포를 기르는 역할:

(1) 새로운 잡교종 세포의 요구 사항을 충족하기 위해 세포 밀도를 높입니다.

(2)? 죽음의 세포를 삼키다

(3)? 성장 자극 인자의 분비는 하이 브리 도마 세포의 성장을 촉진합니다.

피더 세포 유형 및 준비 방법

(1)? 마우스 복강 대 식세포

(2)? 쥐 비장 세포

(3)? 섬유 아세포

3.? 비장 세포의 분리

(1)? 경추를 잡아당겨 쥐를 죽이다.

(2)? 무균 수술로 비장을 절제하다

(3)? 청소 및 연삭

(4)? 세포를 수집하다

(5)? 원심세탁

(6)? 세포 수

4.? 세포 융합: 골수종 세포와 비장 세포를 1: 10 또는 1:5 의 비율로 섞어 융합 촉진제 PEG 를 넣는다.

세포 융합 방법: 페그 융합, 센다이 바이러스, 전기 융합.

5. 모자 선택 문화

HAT 선택성 배양의 원리: 세포 DNA 생합성을 위한 정확한 주요 경로와 보상 경로. A 의 존재가 DNA 합성을 차단하는 주요 경로일 때 대리 보상을 통해 DNA 를 합성해야 한다. 이때 HGPRT 가 H 를 통해 DNA 를 합성하거나 TK 가 T 를 통해 DNA 를 합성해야 합니다.

HPRR 결함형 골수종 또는 TK 결함형 흉선 간 키나아제를 선택한 세포를 친본으로 학교는 모든 조건의 DNA 배양기를 통해서만 합성할 수 있기 때문에 교잡세포는 상호 보완작용을 통해 HGPPT 나 TK 유전자를 얻을 수 있다. 잡교 세포만이 생존할 수 있고, 효소 결핍 세포는 전혀 생존할 수 없고, 단일 복제 B 세포는 일반적으로 오래 자랄 수 없고, 잡교 세포를 분리하는 역할을 한다.

세포 성장: 융합 3 ~ 4 일 후 골수종 세포를 볼 수 있는데, 이것은 혼합과 밝은 복제품입니다. 융합 후 7-9 일째에 상청액을 배양하여 특이항체 검사를 하다.

선별 후 살아남은 세포는 비장 세포와 골수종 세포의 융합 세포이다.

6.? 양성 클론의 스크리닝

단일 클론 항체 분비를위한 하이 브리 도마 세포의 검출

면역 효소 기술: ELISA 소개

면역 형광 기술: 간접 면역 형광 측정과 스트리밍 세포술 (음성 대비: 골수종 세포 배양 상청액, 양성 대비: 면역 마우스 혈청)

7.? 복제 배양: 양성 세포의 단일 복제

복제는 단세포 번식과 증폭이 통일된 특징을 가진 세포 집단을 형성하는 과정을 말한다.

일반적인 방법은 유한희석법과 연진지복제 기술이다.

제한적 희석법: 양성 분비공에서 잡교종 세포를 수집한다.

연진지복제 기술: 양성 분비공에서 잡교종 세포를 모아 연진지배양기에 적당한 농도의 잡교종 세포를 넣어 세포 증식이 있는 세포 집락을 형성한다.

단일 클론 항체 식별;

(1)? 항체 민감성 실험: 복수와 배양기 상청액의 효능을 측정한다.

(2)? 항체 특이성 감정: 다른 항원과 상호 작용하는지 여부.

(3) 항체 역가의 결정

(4)? 항체 하위 등급: IgG(IgG 1, IgG2, IgG3), IgM.

(5)? 항체 친화력 감정

(6)? 에피토프 분석 식별

8. 단일 복제 항체 확대 생산: 세포 배양법, 쥐 체내 유도법, 생물반응기.

세포 배양법: 배양병이나 배양통에서 잡교종 세포를 배양하고 청액을 수집하여 항체 정제를 한다.

체내 동물 유도 방법: Balb/c 쥐 복강 주사 0.5ml 액상 좌측 탈갑식탄, 복강 접종 잡교종 세포, 복수 수집.

생물 반응기: 발효기 배양

단일 클론 항체 배양의 일반적인 문제점:

(1)? 오염: 양식 환경, 운영

(2)? 융합 세포는 성장하지 않는다: 페그, 혈청, HAT 배양기.

(3)? 항체 분비 부족: 지균오염, 세포 돌연변이, 배양 시스템에 문제가 있다.

(4)? 하이 브리 도마 세포를 복제하기가 어렵습니다: 혈청 품질, 세포 활성

세 번째 부분? 유전 공학 항체 준비 기술

유전공학 항체: 유전공학 수단을 통해 개인의 뜻에 따라 세포를 인위적으로 개조하는 기술.

장점은 특이성이 높고, 품질이 안정적이며, 비용이 저렴하며, 공예가 간단하고, 이원성이 낮아지고, 침투성이 좋고, 기능이 풍부하다는 점이다.

1. 마우스 항체 인간화

쥐 항체 응용의 장애: 면역원성, 반감기 단기, 항체 기능 단편 비활성화.

1 ..? 키메라 항체: 가변 영역 유전자의 복제, 표현 벡터의 구축 및 키메라 항체 표현입니다.

2.? 항체 손질

둘째, 소분자 항체: Fab 항체, Fv 항체 및 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, 최소 식별 단위.

소분자 항체 이점:

(1) 원핵 시스템에서 표현할 수 있어 생산 비용을 절감할 수 있습니다.

(2) 분자량이 적어 침투력이 강해 아궁이에 쉽게 들어가 종양 등 질병 치료에 좋다.

(3) Fc 단편을 포함하지 않고 Fc 수용체와 결합하지 않으면 광범위하게 분포된 Fc 수용체의 악영향을 줄일 수 있다.

(4) 체내 반감기가 짧아 체내 유독물질 제거에 유리하다.

(5) 더 많은 유전 공학을 용이하게한다.

셋. ] 항체 기반 애플리케이션

1 ..? CAR-T 면역 요법:

CAR-T 면역요법: 항원 수용체를 키메라하는 T 세포 면역요법은 환자 자신의 면역세포를 이용하여 약물이 아닌 암세포를 제거하는 새로운 계세포요법이다.

CAR-T 기술: 유전자 변형 T 세포의 완전 키메라 항원 수용체를 통해 종양 세포에 저항하는 요법. 키메라 항원 수용체는 종양 관련 항원이나 종양 특이성 항원을 특이적으로 식별하여 결합 후 T 세포에 활성화 및 증식 신호를 전달하여 T 세포를 활성화, 증식 및 방출하여 종양 세포를 죽인다.

2. 면역 검문소

3.? 항독소

4.? 물리적 출력 코어

5.? 이중 특이항체

섹션 iv [endif] 항체 라이브러리 기술

항체 라이브러리 기술: 유전자 복제 기술을 통해 항체 경체인 및 중체인 가변 영역 유전자 전체를 복제하고 원핵 표현 전달체로 재구성하며 원핵 시스템을 통해 기능성 항체 분자 조각을 직접 표현하고 특이항체 분자와 가변 영역 유전자를 선별합니다.

1. 파지 디스플레이 기술 원리: 파지 디스플레이 기술은 외원 단백질 또는 DNA 서열을 파지 껍데기의 적절한 위치를 찾아 외원 유전자가 껍데기 단백질의 표현에 따라 표현될 수 있도록 하는 동시에, 파지가 재조립됨에 따라 외원 단백질도 세균 표면의 생명기술을 보여줄 수 있다. 지금까지 사람들은 단일 체인 실크 디스플레이 시스템, T4 파지 디스플레이 시스템, 플루토늄 디스플레이 시스템 등에 의존하고 있다.

둘째, 파지 항체 준비의 기본 절차

1 ..? 림프세포를 수집하고, mRNA 를 추출하여 cDNA 로 전송하거나, Spock 게놈에서 직접 DNA 를 추출한다.

2.? DNA 증폭을위한 항체 가변 영역 유전자

[재조합 파지 라이브러리 구축

4.? 원하는 특성을 가진 재조합 파지 스크리닝

5.? 돌연변이나 체인 교체를 이용하여 친화력을 성숙하게 하다.

셋째, 파지 항체 기술의 특성

1 ..? 필터링 단계는 간단하고 신속하며 효과적입니다.

2.? 필터링 프로세스가 확대되어 10 10 이상의 클론을 한 번에 필터링할 수 있습니다.

3.? 항체 유전자형은 표현과 밀접한 관련이 있으며, 유전자가 안정되어 쉽게 변형된다.

자연 면역계의 친화력 성숙 과정을 시뮬레이션합니다.

5.? 수동 접종은 필요 없습니다

6.? 동물의 다중 복제 항체 대신 사용할 수 있습니다.

7.? 의료의 어려운 시기를 세우다. 체외 임의 조합 경체인 및 중체인 가변 영역 유전자는 체내에 존재하는 경체인 및 중체인 조합을 만들어 새로운 특이항체 획득을 가능하게 한다.

8.? 방안과 체계에서 표현할 수 있어 대규모 생산을 용이하게 하고, 비용이 저렴하다.

넷째, 항체 라이브러리 기술의 응용

1 ..? 모든 인간 항체 준비

2.? 개선 된 유전 공학 항체