모세관 전기영동을 위한 고속 모세관 전기영동(CE) 분리 시스템

모세관 영역 전기영동은 칩 모세관 전기영동에 의한 단백질 분리를 위한 가장 기본적인 분리 모드입니다. 이는 전기장에서 서로 다른 단백질 분자의 서로 다른 이동 속도를 기반으로 분리를 달성하는 간단하고 빠른 분리 방법입니다. 구역 전기영동 분리 모드를 사용하여 다양한 단백질 샘플을 성공적으로 분리했습니다.

Colyer 등은 모세관 전기영동 칩을 사용하여 구역 전기영동 모드에서 인간 혈청 단백질 샘플을 분리했으며 4개의 단백질 구역(즉, IgG, 트랜스페린 및 α-1-항트립신)을 구별할 수 있었습니다. 알부민 밴드는 각각 혈청 단백질 샘플의 7, p, dl 및 알부민 밴드를 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 단백질의 형광 표지는 분리 후 수행됩니다. 혈청 단백질 표지를 위한 형광 염료인 TNS(2-toluidinonaphtha.1-ene-5-sulfonate)의 민감도가 낮기 때문에 실제 인간의 5개 구역을 분리하는 것은 불가능했습니다. 혈청 단백질 샘플. Xiao 등은 50mmoVL 인산염 완충액(pH 2.15)을 작업 완충액으로 사용하는 구역 전기영동 모드를 사용하여 30um의 채널 폭을 갖는 폴리디메틸실록산(PDMS) 칩에서 이를 35초 만에 달성했습니다. . Dodge 등은 마이크로 밸브와 마이크로 펌프를 통한 액체 흐름을 효과적으로 제어하기 위해 8개의 마이크로 밸브와 1개의 마이크로 펌프를 통합한 PDMS 칩을 설계했습니다. 그들은 먼저 구역 전기영동의 분리 모드를 사용하여 소 혈청 알부민과 미오글로빈을 분리한 다음, 효소 가수분해를 위한 밸브의 작용을 통해 분리된 단백질 성분을 마이크로 믹서에 도입하고 마지막으로 제품에 대한 질량 분석을 수행했습니다. 이 연구는 칩 기술을 사용하여 질량 분석 분석 전에 복잡한 단백질 샘플을 전처리할 수 있음을 보여줍니다. Zhuang 등은 면역글로불린, O/1-항트립신, 소 혈청 알부민 및 철 수송 단백질을 분리하고 소변 샘플의 전기영동 분석을 위해 석영 칩의 칩 전기영동 완충 시스템으로 75mmol/L 붕산염 완충액(pH 10.3)을 사용했습니다. 임상적으로 진단된 임신성 고혈압, 류마티스성 심장질환, 다발성 골수종 환자를 대상으로 2분 이내에 American Helena 전기영동 시스템과 일치하는 분석 결과를 얻었습니다.

칩 모세관 전기영동을 이용한 단백질 분리 연구에서 해결해야 할 중요한 문제는 채널 표면에 거대분자 단백질이 흡착되는 문제이다. 단백질과 칩 채널 내벽 사이의 작은 흡착 효과는 단백질의 분리 효율을 감소시켜 피크 모양이 넓어지고 꼬리가 형성되어 분리의 재현성에 영향을 미칩니다. 모세관 영역 전기영동 분리 모드에서는 단백질 흡착을 억제하기 위해 일반적으로 두 가지 방법, 즉 채널 내벽의 영구적인 변형과 완충액에 첨가제를 추가하는 동적 변형이 사용됩니다.

Wu 등은 구역 전기영동 모드에서 두 가지 기본 단백질(리소자임 및 리보뉴클레아제)과 두 가지 일반적인 단백질을 효과적으로 분리하기 위해 다층 88% 가수분해 폴리프로필렌 알코올(PVA) 변형 PDMS 칩을 사용했습니다. 소 혈청 알부민 및 경구 락토글로불린). 이 코팅은 pH 3~11 범위에서 전기삼투 흐름 및 단백질 흡착의 생성을 억제할 수 있으며, 70회 연속 실행 후에도 분리 효과가 여전히 매우 좋습니다. 이어 연구팀은 자기조립법을 이용해 PDMS 칩 채널 표면에 에폭시 변성 고분자 코팅을 처리해 단백질 흡착을 억제하고 라이소자임과 리보뉴클레아제 A를 분리하는 데 성공했다. Chiem 등은 단백질 흡착을 억제하기 위해 런닝 버퍼에 무기 전해질 NaCl과 중성 계면활성제 Tween 20을 첨가하고, 칩 모세관 영역 전기영동을 사용하여 단일클론 항체를 분리하고 분석했습니다. 겔 전기영동은 단백질체학 및 단백질 분리 연구에서 널리 사용되는 분리 기술입니다. 이는 겔과 같은 폴리머를 분리 매체로 사용하고 네트워크 구조를 사용하여 측정되는 구성 요소의 다양한 분자 부피를 기반으로 분리하는 분리 모드입니다. 겔 전기영동 모드를 사용하여 칩의 단백질을 분리하는 것은 분리 작업의 고속 및 고효율을 달성하는 데 더 도움이 됩니다. Yao 등은 단백질 분리를 위한 칩 SDS 모세관 겔 전기영동 시스템과 기존 모세관 겔 전기영동 시스템의 성능을 비교하기 위해 SDS(나트륨 도데실 황산염) 겔 전기영동 분리 모드를 사용했습니다. 결과는 전자의 분리 효율이 그보다 훨씬 더 우수하다는 것을 보여주었습니다. 후자의 경우 분리 시간도 후자보다 상당히 낮습니다.

기존 모세관 겔 전기영동과 마찬가지로 칩 모세관 겔 전기영동에 일반적으로 사용되는 스크리닝 미디어도 겔형과 비겔형 고분자 용액의 두 가지 유형으로 구분됩니다. 가교된 폴리아크릴아미드 겔은 널리 사용되는 겔 스크리닝 매체이며, Herr 등은 광중합을 이용하여 전통적인 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS·PAGE) 단백질 분리 방법을 처음으로 칩에 이식했습니다. 스크리닝 매체로 6% 농도의 연결된 폴리아크릴아미드 겔을 칩 채널에 준비하고 상대 분자 질량(Mn) 범위가 5,500~39,000인 5개의 단백질을 30초 이내에 분리하여 분석했습니다. 4mm에 불과하고 분리 효율은 이론 단수 4.41×105에 도달합니다. 이후 연구그룹은 단백질 샘플의 사전 농축을 위해 마이크로채널에 22% 농도의 가교 폴리아크릴아미드 막을 준비하여 상대분자량이 12,000~205,000인 단백질 분자를 효과적으로 농축했으며, 교차결합된 폴리아크릴아미드 막을 준비했다. 8% 농도의 연결된 폴리아크릴아미드 겔을 분리용 체질 매체로 사용했습니다.

Agirregabiria 등은 폴리메틸메타크릴레이트(PM-MA) 칩에 마이크로채널을 만들기 위해 SU-8 광학접착제를 사용했고, 단백질을 분리하기 위해 12% 농도의 폴리아크릴아미드 겔을 사용했습니다. 그런 다음 연구팀은 칩에 금속 전극을 통합하고 동일한 분리 모드를 사용하여 상대 분자 질량이 각각 20,000과 97,000인 트립신 억제제와 포스포릴라제라는 두 가지 단백질을 성공적으로 분리했습니다. 그러나 가교형 폴리아크릴아미드 겔은 제조가 복잡하고 사용이 어려운 등의 문제점을 가지고 있다. 이에 비해 선형 폴리아크릴아미드(PLA), 폴리비닐알코올(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO)와 같은 비접착제 스크리닝 매체는 준비가 간단하고 사용이 간편하며 먼저 중합한 후 별도의 절차 없이 채널에 주입할 수 있습니다. 채널에서 처리를 수행해야 하는 필요성. 중합 반응과 같은 장점이 있으며 복잡한 채널 시스템에 사용하기에 적합합니다. 따라서 비겔 체질 매체는 칩 모세관 겔 전기영동에 널리 사용됩니다. Yao 등은 SDS 14·200 겔 완충액(Beckman Coulter Company 제품)을 사용하여 35초 이내에 유리 칩에서 상대 분자 질량이 9,000~116,000인 6개의 단백질을 분리했습니다. Giordano 등은 단백질의 동적 라벨링을 위해 샘플과 버퍼에 NanoOrange 염료를 추가하고 분리 버퍼 시스템을 최적화했으며 최종적으로 5% PEO(M, = 100,000)를 체질 매체로 선택했습니다. 이 시스템은 소혈청 알부민 검출한계가 500ng/mL로, 실제 인체 혈청 시료의 분리 분석을 완료했다.

칩 모세관 겔 전기영동에서 채널 내벽의 단백질 흡착은 여전히 ​​해결해야 할 중요한 문제입니다. Bousse 등은 폴리디메틸아크릴아미드(PDMA)를 사용하여 유리 칩 마이크로채널의 내부 벽을 물리적으로 코팅하여 전기삼투 흐름을 0.5×10~m zV·s로 줄였습니다. Bio-Rad사의 단백질 표준시료는 SDS 겔 전기영동 분리 모드로 40초 이내에 분리되었으며, 분리 효율은 107 plate/m에 달했습니다. Nagata 등은 PMMA 칩에 PEG 코팅을 사용하고 체질 매체로 5% 선형 폴리아크릴아미드를 사용하여 분리 길이가 3mm인 채널에서 트립신 억제제, 소 혈청 알부민 및 갈락토시다제를 달성했습니다. 분리 시간은 단 8초. 칩 등전점 포커싱에 의한 단백질 분리 원리는 기본적으로 기존 모세관 등전점 포커싱의 원리와 동일하며, 둘 다 서로 다른 등전점(pI)을 기준으로 단백질을 분리합니다. Hofmann 등은 처음으로 모세관을 단백질 분석에 적용했습니다.

Li 등은 등전위 포커싱 모드를 사용하여 PDMS 칩과 폴리카보네이트(PC) 칩에서 소 혈청 알부민과 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 분리했습니다. Daset al. 26 3 폴리머 칩을 사용하여 등전점 전기영동 모드에서 분리 길이와 전압 조건을 최적화하여 1.5분 이내에 1.9cm 길이의 채널에서 녹색 형광 단백질과 R 피코에리트린을 최종 분리했으며, 분리 전압은 500V입니다. Cui 등은 등전점 초점 분리 모드를 사용하여 PDMS 칩에서 녹색 형광 단백질, 알로피코시아닌 및 피코에리트린을 성공적으로 분리했습니다. 저자는 또한 시료와 분리 매체의 첨가물 메틸셀룰로오스의 농도를 변경하면 단백질 분리를 완료하는 데 필요한 채널 거리가 변경될 수 있다고 보고했습니다. Tsai 등은 헥사메틸디실록산 플라즈마 중합 막을 사용하여 유리 칩 채널을 수정했습니다. 단백질 흡착이 억제되었으며, 피코시아닌(pI: 4.65), 헤모글로빈(pI: 7.0), 시토크롬 C(pI: 9.6)의 3가지 단백질이 혼합된 혼합물을 등전점집중분리모드로 3분 이내에 분리가 완료되었으며, 분리 효율은 19,600플레이트/m였습니다. Huang 등은 단백질을 분리하기 위해 칩 등전점 포커싱을 사용할 때 단백질 흡착을 억제하기 위해 양쪽성 전해질 용액에 첨가제로 하이드록시메틸셀룰로오스를 첨가했습니다. 칩 모세관 전기영동 응용 분야의 성공은 고속의 효율적인 칩 2차원 전기영동 기술 개발을 촉진했습니다. 여러 구성 요소가 포함된 복잡한 단백질 시료의 경우 기존의 1차원 분리 방법은 일반적으로 요구 사항을 충족할 수 없으며 분리 효율을 높이고 피크 용량을 늘리려면 2차원 분리 기술을 사용해야 합니다. 전통적인 모세관 전기 영동 시스템과 비교하여 칩의 2차원 전기 영동 분리는 복잡한 2차원 모세관 전기 영동 인터페이스를 만들 필요 없이 칩 채널 구조를 설계하여 채널의 직접적인 교차 또는 연결을 실현할 수 있으므로 필요가 없습니다. 데드 볼륨의 존재로 인한 밴드 확장.

칩 2차원 전기영동을 이용한 단백질 분리 연구에서 1차원 분리 방식은 대부분 등전집속방식을 사용한다. Chen 등은 1차원 등전점 초점화 및 2차원 겔 전기영동을 사용하여 형광 표지된 소 혈청 알부민 및 탄산 탈수효소 및 텍사스 레드 표지 난알부민을 분석하는 2차원 모세관 전기영동 PDMS 칩을 제작했습니다. Li 등은 등전위 포커싱과 겔 전기영동을 결합하여 폴리머 코어의 2차원 분리를 위한 4t 칩을 설계했습니다. 단백질 샘플의 1차원 등전점 초점 분리를 완료한 후 여러 병렬 채널에서 2차원 겔 전기영동 분리를 완료할 수 있습니다. 전체 분리 공정은 10분 이내에 완료되었으며, 피크 용량은 1700에 도달했습니다.

Herr 등: "1은 교차 채널 구성을 사용하여 2차원 등전집속이 없는 영역 전기영동 칩 시스템을 개발했습니다. 칩 채널은 폭이 200미터이고 깊이가 20미터입니다. 테스트할 샘플은 등전집속으로 분리됩니다. 측면 채널에서 분리된 샘플 구역은 2차원 분리를 위해 세로 구역 전기영동 채널로 이동되었습니다. 시스템은 분리 성능을 평가하기 위해 형광 현미경 이미징을 사용했으며, 마이크로밸브를 만들어 분리 피크 용량이 1300에 도달했습니다. PDMS 칩에서는 1차원 등전점 전기영동 시스템과 2차원 겔 전기영동 시스템 사이의 분리 완충액이 섞이는 것을 방지하기 위해 20분 이내에 PMMA 칩에서 4개의 표준 단백질을 효과적으로 분리하는 2차원 단백질 전기영동 분리를 수행합니다. SDS 겔 전기영동 및 미셀 동전기 모세관 전기영동 시스템은 12분 안에 10개의 단백질을 분리할 수 있으며, 최대 용량은 약 1,000개입니다. 단백질 효소 가수분해물의 분리 및 분석에 주로 사용되는 차원 분리 시스템은 일반적으로 1차원 분리는 미셀 동전기적 모세관 전기영동 또는 모세관 전기 크로마토그래피 모드를 사용하고, 2차원 분리는 구역 전기영동 모드를 사용합니다. 연구진은 최초로 미셀 동전기 모세관 전기영동(1차원)과 구역 전기영동(2차원)을 결합한 2차원 분리 시스템을 유리칩에 구축하고 시토크롬C, 리보뉴클레아제, d에 적용했다. L-알부민과 같은 트립신 분해산물의 분리. 이후 연구팀은 시스템을 개선해 1차원 전기영동 채널의 길이를 늘렸고 확산을 줄이기 위해 얇은 코너 채널을 사용해 약 15분 만에 피크 용량 4200개를 분리했다. 2001년에는 개방형 전기 크로마토그래피와 구역 전기 영동을 결합한 칩 2차원 전기 영동 시스템을 개발했습니다. 전기 크로마토그래피 분리 부분은 25cm 길이의 순환 옥타데실트리메톡시실란 코팅 채널을 사용하고 구역 전기 영동 부분은 길이가 있는 직선 채널을 채택했습니다. 오전 1시 2분, 카세인 트립신 가수분해물을 13분 이내에 분리하는 데 성공했습니다.

2차원 칩 분리 시스템은 1차원 분리 칩에 비해 높은 분리 효율과 피크 용량을 갖고 있어 복잡한 단백질 시료의 분리에 더 큰 역할을 할 것으로 기대된다. 미세 유체 칩 모세관 전기 영동 시스템은 특히 임상 테스트 및 현장 모니터링에서 단백질 분리 및 분석에 탁월한 이점을 가지고 있으며 동시에 분석 장비의 통합, 소형화 및 통합에 기여합니다. 휴대성의 발전도 매우 중요합니다. 문헌 보고서에 따르면 Renzi 등은 휴대용 미세유체 칩 전기영동 단백질 분리 장치를 개발했습니다. 이 장치는 전기영동 칩, 소형 레이저 유도 형광 검출 시스템 및 고전압 전원 공급 장치로 구성되며, 크기는 11.5cm × 11.5cm × 19.0cm에 불과하며 현장 분석, 병상 의료 진단에 사용할 수 있습니다. 법의학 분석. 최근 몇 년 동안 중국에서는 임상 소변 단백질 및 지단백질 검출을 위해 칩 모세관 전기영동을 사용하는 것에 대한 보고가 있었습니다. 최근 Pandey 등은 Caliper와 Agilent의 P200 단백질 칩을 사용하여 미량의 알부민뇨를 검출하고, 통합되고 자동화된 단백질 전기영동 분리 및 형광 검출을 실현했으며, 임상 실험실에서의 적용을 실현했습니다.

현재 많은 과학 연구자들이 단백질 분리 분석 및 프로테옴 연구에서 복잡한 샘플을 분리하고 분석하는 시스템의 능력을 더욱 향상시키기 위해 미세유체 칩 모세관 전기영동과 질량 분석법의 결합을 연구하고 있습니다. 이는 특히 복잡한 단백질의 다차원 분리 및 분석에 폭넓은 응용 가능성을 가지고 있습니다. 빠르고 효율적인 특성을 지닌 샘플, 칩 모세관 전기영동은 1차원 분리 방법으로 사용되어 단백질 분석의 처리량을 크게 높일 수 있습니다.

지속적인 연구 심화와 관련 기술의 지속적인 개발로 미세유체 칩 모세관 전기영동 단백질 분리 기술은 점점 더 성숙해지고 생화학적 분석, 임상 진단 및 단백질체 연구 분야에서 중요한 역할을 할 것으로 믿어집니다.